前幾期真相文章得到了讀者積極的反饋，其中提問最多的就是這個公式:
首先，大家覺得這個公式太有用了。以前只能定性地評價圖像質量，現在一下子就能直接算出信噪比，瞬間高大上了許多有木有。然而，杯具的現實是，95%的人都找不到相機的出廠報告，也就是說並不知道自己相機的 Gain 是多少。不知道 Gain, 那這個公式豈不就成了浮雲啊！
別急，本期我們就來披露兩分鐘測算相機增益的秘笈，大家準備好打賞哈！
01公式推導
哈哈，公式是煩人的，但也是必須的。
我們知道，當相機工作在光子散粒噪聲(Shot Noise)限制區時：
相機拍到的圖像，亮度是以灰度值(ADU)為單位的, 我們可以用圖像分析軟體（如我們用過的 Image J）計算出感興趣區 (ROI) 的平均灰度值 Mean-ADU 和標準差 SD-ADU (即以 ADU 為單位的噪聲)。
以上公式①變為:
這樣，我們就可以計算出:
以上計算中，圖像的標準差即代表噪聲的前提是，圖像區域內沒有任何樣品結構造成的亮度變化，否則標準差還包含這個結構信息。為此，我們可以連續拍攝兩張同樣場景的圖像，然後把兩張圖像相減。相減後的圖像就只包含光子散粒噪聲了。如果以 SD-subtract 代表差值圖像的標準差，SD-image1和SD-image2代表單張圖像的標準差，則以下公式成立：
因為兩張圖像設置完全相同，SD-image1 = SD-image2，所以：
那麼，以上公式最後變為:
這樣算出的 Gain 單位為 e–/ADU。
02拍攝圖像
太好了，公式終於結束了。現在就來拍攝圖像，通過公式⑤，我們知道只需要拍攝3張圖像，就可以計算出 Gain 了。
好的，兩分鐘計時開始哦~
拍攝一張短曝光時間的黑圖像 (bias 圖像) 以計算offset：我們知道，對同一臺相機，偏置（offset）是一個常數。方法很簡單，在相機完全無信號的情況下，（如顯微鏡設為全部光都到目鏡，或者蓋上鏡頭蓋），將曝光時間設為0, 拍攝一幀圖像。拍攝兩張平均亮度大概在相機動態範圍中間區域的圖像。如果您的相機是12bit的，有4096 灰度級，那麼圖像的平均亮度最好在 2000 左右。這個可以通過調整曝光時間，或照明光強度來實現。當然，其實要求並不那麼嚴格，基本要求是圖像上不能有接近飽和(＞4000 ADU, 此時相機失去了線性度)，或太暗( <200ADU, 此時相機沒有工作在光子信號限制區， 我們計算的條件不滿足)的區域。如果您的相機是 14bit 的，那麼灰度級是16384, 上面的值需要按比例進行調整。
計 算
1. 首先在 Image J中打開 bias 圖像，用 Analyze>measure, 得到圖像的 mean 值即為 Offset。
2. 接下來，打開另外兩張圖片，選擇 Analyze > Measure 得到兩張圖片的平均灰度值；然後再用 Analyze > Summarize 就可以得到平均值 Mean-Image1, Image2
3. 計算差異圖像的標準差：選擇Analyze > Image Calculator，將兩張圖片進行 subtract，並勾選 32-bit (float) result，得到兩張圖片的差值圖像。
選擇 Analyze > Measure 即可看到差值圖像的標準差 SD-substarct：
4. 然後代入前面的公式⑤，我們就可以算出系統增益啦！（表忘了減去偏置值哦~）
計時結束，完美！第一次可能慢一些，第二次做應該兩分鐘都不用吧！
我們還可以設置不同的曝光時間，重複上述步驟，用多次測量所得的值作圖，通過擬合曲線來觀察增益的線性度。Photometrics 官網上還為大家提供了一個使用此方法 Gain 的小工具哦，如有需要，請訪問連結：https://www.photometrics.com/resources/imaging-tools/mean-variance-calculator.php
以上就是兩分鐘快速計算相機增益的方法啦！希望對大家有所幫助。另外我們總結了一些關於 Gain 的事實。
關於Gain的一些事實
CCD/CMOS 相機的 Gain 是出廠設置好的，不會改變；EMCCD 的 EM Gain 會隨著使用老化衰減，正常使用 7~10 年左右；我們推薦每隔一段時間校準一次；
根據廠家不同，Gain 有多種表示方式：有些相機只有一個 Gain ，有些有三個 Gain ，有些連續可調(如 0.5x-20x), 或 ISO100 – ISO1200 等等。以上測試，只對應當時設定的那個 Gain 有效；如果實際使用時，因為樣品或成像方式變化，需要改變 Gain 的設置，對每個 Gain 都需要測量。建議在保存圖像時，在文件名上反映出 Gain 的設置；同一臺相機，Gain 的倍數越大，相機的滿阱容量越小(更早飽和)；
同一臺相機，在軟體中調節 Gain 的設置，圖像亮度會變化，但實際探測到的電子數不變，因此信噪比變化不大；Binning 不影響 Gain;
行行好，把測算出的 Gain 值記在小紙片上貼起來供大家使用吧！
如果您有任何疑問，請隨時留言與我們聯繫。敬請期待真相系列下一期~