草菇（Volvariella volvacea）又稱作中國蘑菇，是熱帶、亞熱帶地區栽培最多的食用菌之一。草菇是典型的高溫型食用菌，適於在高溫環境下生長。當生長溫度低於15 ℃時，草菇菌絲體的活力下降、生長變緩甚至死亡。當貯藏溫度低於15 ℃時，草菇子實體也在12 h內發生自溶。草菇低溫自溶的特性制約了草菇菌種保藏和子實體生產流通，嚴重影響了該產業的健康可持續發展。
福建農林大學食品科學學院,福建省農副產品保鮮技術開發基地的吳志亮、黃 瑩*、王則金*以草菇子實體為對象，利用蛋白質組學技術研究草菇子實體響應低溫脅迫的差異蛋白質，揭示草菇發生低溫自溶後的代謝通路變化，旨在為草菇低溫自溶機理的進一步研究提供參考。
草菇子實體由菌膜、菌託、菌傘、菌柄、菌褶構成。新鮮草菇的外部上方為灰黑色，往下至菌託漸淡，位於內部的成分均為白色，帶有草菇特有清香（圖1A）。經低溫（4 ℃）處理12 h後，草菇發生了自溶，草菇表面覆蓋水珠並發生褐變，內部以菌膜褐變最為嚴重，內部間隙可見自溶產生的積液，質地變軟萎蔫，發出腐爛的惡臭味（圖1B）。
由圖2可知，樣品的SDS-PAGE圖條帶清晰，樣品之間平行度較好，對照組與低溫處理組之間具有一定差異。蛋白質提取樣本量足夠，樣品量適於進行後續實驗。
草菇在4 ℃下處理12 h後，其蛋白質表達發生了一定的變化。樣品經質譜檢測，篩選出2 455 種Unused≥1.3的可信蛋白質。以P＜0.05、變化倍數≥1.5或≤0.667（1/1.5）為依據篩選出332 種差異蛋白質，其中包含了64 種上調蛋白質、268 種下調蛋白質。
為進一步了解草菇在低溫脅迫下差異蛋白質的生物學功能，對差異蛋白質進行GO注釋分析，從生物學過程、細胞組成和分子功能方面進行富集分析。生物學過程注釋表明差異蛋白質主要參與細胞過程（37.04%）、代謝過程（31.71%）、定位（10.42%）、生物調節（8.33%）、細胞成分的組織或生物發生（7.18%）、應激響應（3.94%）。細胞組分注釋表明差異蛋白質主要分布在細胞部分（37.68%）、含蛋白質的複合物（21.92%）、細胞器（14.04%）和細胞器部分（13.05%）等。分子功能主要涉及結合活性（45.97%）、催化活性（40.52%）和結構分子活性（8.31%）等。
在P＜0.05的範圍內，有109 種差異蛋白質被注釋到57 條KEGG通路上。其中差異蛋白質數量最多的通路是核糖體，有28 種，通路圖是map03010（圖5）。其次是RNA轉運，有15 種。與甲型流感相關的差異蛋白質有13 種。與肌動蛋白細胞骨架調節相關的差異蛋白質有11 種。與緊密連接相關的差異蛋白質有10 種。與病毒致癌相關的差異蛋白質有10 種。與精氨酸和脯氨酸代謝相關的差異蛋白質有10 種。由此可見，草菇在受到低溫脅迫後，核糖體、RNA轉運等代謝通路受到較大影響。
為研究草菇響應低溫脅迫的差異蛋白質，將鑑定到的蛋白質和COG資料庫進行比對，共計328 種蛋白質獲得注釋，分為22 種COG功能，分別用A～Z表示。如表3所示，P＜0.05的功能聚類有J（翻譯、核糖體結構和生物合成）、Z（細胞骨架）、Y（細胞核結構），分別包含61、19、8 種差異蛋白質。這表明低溫脅迫主要影響了草菇的J、Z、Y功能，結果與KEGG通路分析結果一致。
篩選常用的內參基因所對應的蛋白質（表4），翻譯延伸因子1-α、β-肌動蛋白、GAPDH在蛋白質水平出現差異表達，不適合作為qPCR驗證實驗的內參基因。選擇變化倍數小於10%的TUB-β作為qPCR驗證實驗的內參基因。NADH-泛醌氧化還原酶是線粒體呼吸鏈的複合物Ⅰ，是具有代表性的差異蛋白質。甘油醛-3-磷酸脫氫酶和NADH-泛醌氧化還原酶的基因轉錄水平表達變化和蛋白質水平一致。
本研究利用iTRAQ蛋白質組學技術研究草菇子實體響應4 ℃低溫脅迫的蛋白質表達變化，從蛋白質水平了解草菇低溫自溶的機理。結果表明，64 種上調蛋白質和268 種下調蛋白質響應低溫脅迫，生物信息學分析從宏觀角度反映了草菇自溶後的生物學功能和代謝通路變化，討論部分具體分析了與能量代謝等7 種代謝過程相關差異蛋白質，認為ATP合成酶β亞基、丙酮酸脫氫酶E1α亞基、碳水化合物酯酶家族9蛋白質、與EXG1-exo-beta-1,3-葡聚糖酶相關的蛋白質、TPS、TP、CAT和核糖體蛋白質等差異蛋白質可能與草菇低溫自溶相關，值得進一步研究。
本文《草菇響應低溫脅迫的差異蛋白質組學分析》來源於《食品科學》2020年41卷19期 212-220頁，作者：吳志亮，黃瑩，王則金。DOI:10.7506/spkx1002-6630-20190829-322。點擊下方閱讀原文即可查看文章相關信息。