前言
歐易/鹿明生物合作客戶安徽農業大學陳國戶課題組在International Journal of Molecular Sciences期刊發表的題為 「Comparative Proteomics Indicates That Redox Homeostasis Is Involved in High- and Low-Temperature Stress Tolerance in a Novel Wucai (Brassica campestris L.) Genotype」的研究成果，通過TMT標記定量蛋白質組學和LC-MS/MS蛋白質組學研究方法，發現了烏菜的氧化還原平衡、光合作用、碳水化合物代謝、熱休克蛋白和信號轉導途徑與耐溫性有關，驗證了維持氧化還原穩態是烏菜新種質耐溫性的重要調控通路。
中文標題：比較蛋白質組學表明，在一個新的烏菜基因型中，氧化還原穩態與高低溫脅迫的發生有關
英文標題：Comparative Proteomics Indicates That Redox Homeostasis Is Involved in High- and Low-Temperature Stress Tolerance in a Novel Wucai (Brassica campestris L.) Genotype.
研究對象：烏菜
發表期刊：International Journal of Molecular Sciences
影響因子：4.556
合作單位：安徽農業大學
運用歐易/鹿明生物技術：TMT標記定量蛋白質組學（由鹿明生物提供技術支持）、LC-MS/MS蛋白鑑定（由鹿明生物提供技術支持）
研究背景
溫度脅迫正成為植物研究中的一個主要問題。低溫（LT）和高溫（HT）的變化預計將極大地影響酶活性、光合作用、碳同化、DNA/RNA穩定性、膜流動性以及轉錄和翻譯速率。烏菜作為一種不結球白菜（NHCC）產量和食用品質也會受其影響。新基因型WS-1是從烏菜一系列種質中鑑定出來的，它對LT和HT的耐受性高於以往實驗中使用的其他基因型。然而，目前尚不清楚哪一種調節途徑在熱應激反應中起主導作用，也不清楚同一通路是否能改善LT和HT耐受性。
本文作者使用串聯質譜標記（TMT）來評估新的NHCC基因型WS-1對LT和HT的反應所發生的分子變化。旨在確定和比較WS-1對LT和HT應激耐受的調控機制。
研究策略
研究結果
1、蛋白質組學定量分析鑑別差異表達蛋白
利用液相色譜-質譜（LC-MS/MS），作者檢測了207427張總譜圖，50800條肽段、23059條唯一肽段和6831個蛋白質（score sequence HT > 0和 unique peptides ≥ 1）（圖1A）。肽段數分布如（圖1B）所示，81.3%以上的蛋白質至少含有兩條肽段。約99.2%的蛋白質具有大於10 kDa的質量，有很好的覆蓋率（圖1C）。大於10%和20%的序列覆蓋率分布分別為61.2%和41.3%，表明數據質量很高（圖1D）。
圖1 | 已鑑定蛋白質的鑑定和定量評價
2、低溫（LT）組和高溫（HT）組共有的DEPs的功能分類
根據（Fold Change >1.2或Fold Change <0.83和p<0.05）篩選標準，共有1732個差異表達蛋白（DEPs）在LT處理中被鑑定，2806個DEPs在HT處理中被鑑定（圖2A）。這些上調和下調的DEPs被分為三組：
（1）710個DEPs是對LT組特異性的；
（2）1022個DEPs對LT和HT組都是共同的，包括172個共同上調的蛋白質，324個共同下調的蛋白質，526個不同調節的蛋白質（圖2B）；
（3）1784個DEPs對HT組是特異性的。
為了確定WS-1的耐溫機制，作者重點研究了在低溫和高溫條件下調節的1022個DEPs的功能。
圖2 | 低溫（LT）和高溫（HT）處理下溫度脅迫響應蛋白的概述
（a）與對照相比，低溫和高溫處理下烏菜葉片差異表達蛋白的數量；
（b）LT和HT共同調節蛋白（1022蛋白）的分布；
根據GO注釋（圖3A），這些「共同調節」蛋白質的功能被分配到幾個類別，包括生物過程、細胞成分和分子功能。對LT/Cont和HT/Cont處理中常用的1022個DEPs蛋白的生物學過程分析表明，其主要通路是小分子代謝過程和對非生物刺激的反應。大多數受調控的DEPs參與各種分子代謝過程（小分子、氧酸、有機酸、單體、羧酸、硫化合物和一元羧酸），其餘的DEPs則參與對刺激的反應。如圖3A所示，LT/Cont和HT/Cont處理組相同的是，大多數受調控的DEPs被預測定位於細胞部分、細胞、細胞內部分和細胞質，表明DEPs主要作用於這些細胞成分。HT/Cont處理中，這些DEPs的主要分子功能是RNA結合和蛋白質結合，而在LT/Cont處理中它們是催化活性和RNA結合（圖3A）。
為了確定與溫度脅迫耐受性相關的代謝通路，根據KEGG資料庫進一步分析了1022個DEPs（圖3B）。大多數DEPs富集在卟啉和葉綠素代謝、核糖體、次生代謝產物的生物合成、穀胱甘肽代謝、代謝通路、碳代謝、光合生物體的碳固定、2-氧羰基水楊酸代謝、胺基酸生物合成，丙酮酸代謝通路（圖3C）。上調的DEPs富集在2-氧羰基水楊酸、光合生物體的碳固定、胺基酸的生物合成和碳水化合物代謝通路上。
圖3 | 低溫和高溫處理下溫度脅迫響應蛋白的研究概述
（a）1022個高低溫處理下常用調節蛋白的GO分類；
（b）1022個高低溫處理下常用調節蛋白的KEGG通路分析；
（c）在每個KEGG通路中，在LT和HT組上調、在LT和HT組下調 和不同調節（一種溫度處理後上調，另一種溫度處理後下調）的1022個差異調節蛋白的百分比。
3. LT和HT處理中上調的DEPs功能分析
接著作者對共有172個在LT和HT中上調的DEPs進一步進行GO（圖4A）和KEGG（圖4B）分析。這172個DEPs位於細胞質、葉綠體和質體中，參與了非生物刺激和脅迫的反應，參與了羧酸、氧酸、有機酸和一元羧酸的代謝過程。KEGG通路分析表明，大多數蛋白質在次級代謝產物生物合成和代謝通路中富集（圖4B）。後對172個在低溫和高溫處理中上調的DEPs進行了更詳細的本體分析，包括氧化還原穩態、光合作用、碳水化合物代謝、熱休克蛋白、信號轉導和代謝過程相關的蛋白。
圖4 | 在低溫和高溫處理中上調的172種蛋白質
（a）兩種處理下上調蛋白的GO分類柱狀圖；
（b）172中上調蛋白在每條通路的百分比；
然後作者又使用STRING資料庫進行了PPI蛋白互作網絡分析，發現穀胱甘肽代謝在所有代謝通路中佔主導地位。此外，GLU1與其他代謝過程有直接或間接的相關性，其中主要的代謝過程是SRK2G（P43292）、FOLD4（a0d3dzn5）、RH14（Q8H136）、HSP17.7（M4DG78）、HSP18.1（M4CEA8）、GGT1（a0d3bw42）、BCAT3（Q9M401）、PDIL1-2（Q9SRG3）、ALDH10A8（a0d3cwl2）、ICDH（A0A078FVI0）和P5CSB（M4DE13）（圖5）。
圖5 | 蛋白互作網絡分析
方形：GO/KEGG term；圓點：蛋白質
4. 低溫和高溫處理上調DEPs相關基因的表達譜分析
為了評估mRNA與蛋白質表達水平的相關性，作者選擇了12個與DEPs相關的基因，在LT和HT兩種條件下上調，RT-PCR分析。結果表明，LT或HT組的大多數基因表達量均高於對照組。
在LT組中，以下基因的表達較高：RD22、SUS1、P5CSB和CYP38（圖6）。與對照組相比，LT和HT處理均能顯著提高sHSP17.7、sHSP18.1、ICDH、PSBP1和ERD10的表達水平。這些結果表明，蛋白質的表達模式並不總是與其轉錄表達模式一致，可能是因為應激相關基因支配了對LT和HT的反應。
圖6 | 低溫和高溫脅迫下植物葉片中與上調差異表達蛋白（DEPs）相關的基因表達
以肌動蛋白（Actin）為內對照，計算其相對表達水平。
5.BccrGLU1在擬南芥中的過表達導致溫度脅迫耐受
為了研究氧化還原穩態對植物耐溫性的影響，我們構建了表達BccrGLU1的轉基因擬南芥（圖7a）。RT-PCR結果表明，在選定的轉基因植株中，bcrglu1的轉錄水平被高度誘導，證實植株已經用35S-BccrGLU1:GFP被成功轉化（圖7B）。在正常生長條件下，野生型（WT）和過表達（OE）轉基因株系之間沒有明顯的表型差異，表明BccrGLU1的過表達不會導致轉基因擬南芥幼苗的表型缺陷。在OE株系中，鐵氧還蛋白（FD）-GOGAT活性在正常條件下顯著高於WT（圖7C）。
為了評價BccrGLU1的作用，對三個OE株系進行了生理學分析。在正常條件下，OE株系穀胱甘肽（GSH）含量高於WT系。在低溫和高溫下，三種過表達植物（OE#1、OE#2和OE#7）的GSH水平顯著高於野生型植物（圖7D）。正常條件下的OE株系的GSH/氧化穀胱甘肽(GSSG)比值與WT無差異，而溫度脅迫下的OE株系的GSH/氧化穀胱甘肽比值明顯高於WT植株(圖7E)。
圖7 | 35S-BccrGLU1:GFP融合蛋白的構建及與擬南芥野生型（WT）和過表達（OE）系溫度脅迫反應相關的生理變化示意圖
（a）35S-ccrGLU1:GFP融合蛋白構建示意圖；
（b）BccrGLU1在T3轉基因植株中的相對表達；
（c）Fd-GOGAT在WT和OE中的活性；
（d）葉片中穀胱甘肽（GSH）的含量；
（e）穀胱甘肽/氧化穀胱甘肽（GSSG）比值
另外，作者通過確定在溫度脅迫下的氧化損傷參數，以評估在OE株系的氧化還原穩態。在正常條件下，OE株系的MDA含量和電解質滲漏量與WT系無顯著差異。當OE株系暴露於LT和HT時，其MDA含量和電解質滲漏量均低於WT系（圖8A、B）。在正常條件下，三個OE系的脯氨酸含量略高於WT系，並且OE系的脯氨酸含量比WT系對LT和HT的反應更高（圖8C）
圖8 | 擬南芥WT和OE系的氧化損傷和脯氨酸含量
（a）擬南芥幼苗丙二醛含量；
（b）擬南芥幼苗電解質滲漏；
（c）擬南芥幼苗脯氨酸含量；
染色模式顯示，與WT相比，OE系在脅迫下的ROS水平較低（圖9A）。與野生型相比，OE席的過氧化氫（H2O2）含量和O2生成速率也降低，這與染色模式（圖9B，C）一致。這些結果表明，BCCRGLU1與活性氧清除相關，以對抗氧化應激。
圖9 | 擬南芥WT和OE株系的氧化損傷
（a）用硝基藍四唑（NBT）和過氧化氫（H2O2）在上排中進行組織化學染色法測定，在下排用DAB染色；
（b）氧氣含量的定量；
（c）過氧化氫含量的定量；
相關討論
圖10 | 對LT和HT處理都響應的上調WS-1蛋白示意圖
紅邊表示上調的蛋白質，箭頭表示正調節，T形條表示負調節
TMT標記定量蛋白質組學分析表明，WS-1的耐溫性可能與多種因素有關，包括穩定的氧化還原內環境、完整的析氧複合物、滲透壓的積累、sHSPs和伴侶的誘導以及代謝過程的增強。
研究者推斷，對LT和HT應激的耐受性涉及一個共同的調節通路，DEPs的表達增加，包括Fe-GOGAT、BADH、P5CS、GGT和AOX，有助於調節氧化還原穩態（圖10）。為了進一步證實氧化還原穩態的作用，研究者在擬南芥中過度表達了BccrGLU1。在LT和HT脅迫下，35S:BCCRGl1植物的GSH含量和GSH/GSSG比值均比WT低，且與WS-1比較蛋白質組學數據一致。結合這些數據，發現氧化還原穩態在提高WS-1細胞對LT和HT脅迫的耐受性方面發揮了重要作用。
研究結論
在本研究中，我們採用串聯質譜（TMT標記定量蛋白組學）結合液相色譜-質譜（LC-MS/MS質譜鑑定）的蛋白質組學方法，鑑定了1022種經LT或HT處理的WS-1共有的差異表達蛋白（DEPs）。在1022個DEPs中，172個對LT和HT都有上調反應，324個對LT和HT都有下調反應，526個對一種溫度脅迫有上調反應，對另一種溫度脅迫有下調反應。為了闡明WS-1的共同調控通路[P3] ，作者進一步分析了172個上調的DEPs。結果表明，烏菜的氧化還原平衡、光合作用、碳水化合物代謝、熱休克蛋白、伴侶和信號轉導途徑與耐溫性有關。此外，35S:BCCRCRGL1在擬南芥中過表達，在溫度脅迫下，穀胱甘肽（GSH）含量降低，穀胱甘肽/氧化穀胱甘肽（GSH/GSSG）比值降低，氧化損傷減少。這一結果與氧化還原穩態相關蛋白的動態調節一致。這些數據表明，維持氧化還原穩態是烏菜新種質耐溫性的重要調控通路。
參考文獻：
Yuan L , Wang J , Xie S , et al. Comparative Proteomics Indicates That Redox Homeostasis Is Involved in High- and Low-Temperature Stress Tolerance in a Novel Wucai (Brassica campestris L.) Genotype[J]. International Journal of Molecular ences, 2019, 20(15):3760.
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文章來源於鹿明生物