歐易/鹿明生物合作客戶甘肅農業大學畢陽教授課題組在Food chemistry期刊發表題為 「Sodium silicate prime defense responses in harvested muskmelon by regulating mitochondrial energy metabolism and reactive oxygen species production」的研究成果。本研究通過TMT標記蛋白質組學研究方法表明，Si處理後的甜瓜果實線粒體通過調節被病原菌感染的甜瓜的能量代謝和ROS的產生，啟動寄主對Trichothecium roseum侵染的抗性，從而降低了甜瓜的腐爛。
中文標題：矽酸鈉通過調節線粒體能量代謝和活性氧的產生來啟動收穫後甜瓜的防禦機制
研究對象：甜瓜線粒體
發表期刊：Food chemistry
影響因子：6.306
合作單位：甘肅農業大學
運用歐易/鹿明生物技術：TMT標記定量蛋白質組學（由鹿明生物提供技術支持）
甜瓜（Cucumis melo L.）因其產量和消費量大而成為重要的農作物。但由於真菌病原體的感染導致甜瓜的產量明顯降低（約20-40%），瓜果質量也隨之受到影響。其中Trichothecium roseum是採摘後引起甜瓜粉腐病的主要真菌。
生理失調、病原菌感染和衰老是導致部分採摘後蔬菜、水果品質惡化的最常見原因。這些疾病與細胞能量有關。然而，水果組織中能量變化的增加和茶多酚的含量變化都會導致水果抗氧化免疫系統的增強。通過提高蔬菜和水果的抗病性，可以減緩衰老病的發生和發展過程。三磷酸腺苷（ATP）由線粒體通過有機酸的呼吸氧化和線粒體電子傳輸鏈的電子轉移到氧氣中產生。在非生物和生物脅迫下，植物線粒體參與了程序性細胞死亡（PCD）的激活和ROS的產生。當真菌攻擊植物時，線粒體可能通過激活各種信號，如一氧化氮、活性氧、激發子或水楊酸，發揮防禦系統的作用。線粒體接收到的信號通常會影響它們的正常功能。這些信號會破壞細胞器的穩定性，並導致呼吸系統、細胞膜的潛能以及活性氧的產生。然而，少有報導涉及果實防禦反應與線粒體之間的關係。
矽（Si）通常被認為是一種安全的物質（GRAS），是激活植物防禦的有效激發因子。植物可以通過激活參與反應的多條通路快速而強烈地對脅迫作出反應。在本研究中，使用矽酸鈉作為主要刺激物，來促進甜瓜果實進入激活期。另一方面，在初步實驗中，蛋白質組的一些研究結果表明，與能量代謝和防禦有關的酶也參與了誘導甜瓜果實對病原菌侵染的抗性。採用兩步Percoll梯度離心法對甜瓜果實中高純度線粒體進行富集，進一步探討其作用機理。檢測ROS的變化和來源，分析能量代謝相關酶的活性。採用串聯質譜標籤（TMT）定量蛋白質組學分析方法，獲得了甜瓜果實線粒體蛋白豐度的整體變化，證實了Si處理誘導抗性的啟動機制。
1. 矽處理可減少真菌接種水果的病斑
接種Trichothecium roseum前12h對甜瓜果實進行矽預處理，7d後病原菌引起的損傷面積明顯減小。接種後5d和7d，Si處理的甜瓜（Si+C）的病斑面積分別比無Si處理的甜瓜（CK+C）減少55%和42%。表明Si處理誘導了接種病原菌的甜瓜果實對粉腐病的抗性。
2.矽處理提高了線粒體中ROS的產生
經矽處理和菌接種的果實（Si+C），超氧陰離子的產生和過氧化氫的積累迅速增加。用DCHF-DA染色法，在（Si+C）處理果實的24h後，在靠近感染點的1cm區域檢測到高螢光。此外，通過染色檢測ROS水平表明了生物脅迫對ROS活化的重要性，並與分析整個甜瓜樣品時用化學方法檢測的結果一致。採用DCHF-DA和Rh123雙染法，測定接種點附近薄壁細胞中活性氧的來源。觀察表明，Rh123的紅色螢光信號與ROS的DCF螢光的綠色信號基本一致，證實線粒體參與了Si處理誘導的ROS產生和病原感染。Si+C樣品的螢光強度明顯強於對照和病原感染（CK+C）樣品，說明Si處理的果實在24h內誘導了明顯的組織氧化爆發。
3.能量代謝和ATP含量變化
病原菌感染、衰老和生理紊亂與各類果蔬尤其是採摘後的細胞能量密切相關。本研究中，經矽處理的甜瓜果實的Trichothecium roseum感染增強了甜瓜組織中與能量代謝相關的酶活性，如SDH、CCO和H+-ATPase。
4.甜瓜線粒體TMT蛋白質組學分析
4.1. 甜瓜果實線粒體蛋白質譜的研究
鑑定到5330個肽和1613個蛋白質。
4.2. 差異表達蛋白的功能分類
層次聚類分析表明，同一處理的每3次重複之間差異表達蛋白的趨勢表現出較好的一致性。比較兩組間的蛋白質豐度，發現19個蛋白表達上調，5個蛋白表達下調（圖1）。24種差異表達的線粒體蛋白的GO分析顯示出高百分比的基因歸因於金屬離子結合、氫離子跨膜轉運活性、TPase活性和氧化還原酶活性。這些差異表達蛋白參與了甜瓜果實線粒體的一些主要生物學過程，從而闡明和證實了Si處理對甜瓜果實激活狀態下線粒體能量代謝的調節機制。
4.3. 與能量代謝相關的蛋白質
與能量代謝相關的上調蛋白包括細胞色素b-c1複合物亞基7-2、細胞色素c氧化酶亞基5b-2、ATP合酶亞基delta、ATPase F1複合物和α亞基蛋白。在本研究中，發現在矽處理和菌接種的甜瓜果實（Si+C）中，ATP合成酶的2個亞基上調，這與H+-ATPase活性和果實細胞內ATP含量的增加一致。在矽處理的甜瓜激活早期，能量代謝的調節是非常重要的。
4.4. 與防禦和應激反應相關的蛋白質
相關研究層表明，生物和非生物脅迫可誘導與防禦和應激反應相關的幾種蛋白質。在本研究中，小分子熱休克蛋白（HSP20）和伴隨蛋白CPN60-2（HSP60）在Si處理的甜瓜中在24h內上調。Si處理的甜瓜中HSPs的激活可能是在早期防禦過程中誘導非生物Si脅迫的結果。
4.5. 糖酵解和TCA循環相關蛋白
Si在生物脅迫條件下也能顯著調節糖酵解途徑蛋白。ROS信號和氧化應激是Si處理後線粒體糖酵解和TCA循環調節的主要原因。
4.6. 與氧化還原過程相關的蛋白質
線粒體的氧化還原狀態通過能量生產和消耗的微妙平衡保持穩定。在Si處理和菌感染（Si+C）體系中，誘導了兩種與氧化還原穩態相關的蛋白，包括乙醛脫氫酶家族2成員B7A和leghemb還原酶。線粒體不僅是果實細胞的能量來源，而且在細胞信號傳導中起著關鍵作用，其信號傳導受氧化還原過程的調控。這兩種蛋白的上調可能與Si處理後病原-宿主相互作用過程中的氧化應激和細胞信號轉導有關。
4.7. 與胺基酸代謝有關的蛋白質
本研究共鑑定到了4種參與胺基酸代謝和γ-氨基丁酸（GABA）運轉的蛋白質。天門冬氨酸轉氨酶在Si處理和菌接種（Si+C）24h後，豐度增加。但參與組氨酸代謝和氨醯tRNA生物合成的組氨酸tRNA連接酶表達下調。在Si處理和菌接種24h後，GABA轉氨酶1和琥珀酸半醛脫氫酶均上調。結果表明，在GABA誘導的植物免疫中，GABA的激活在Si誘導抗性機制和抗性機制之間建立了重要的聯繫。
4.8. 雜類和非分類蛋白質
DNA迴旋酶亞基A在Si處理和菌接種（Si+C）24h后豐度增加。此外，本研究還觀察到一種ATP依賴的鋅金屬蛋白酶FTSH和FTSH 2、含TraB結構域的蛋白質和不確定蛋白Csa_6G186365。然而，這些蛋白在防禦啟動中的作用還需要進一步研究。
該研究發現Si處理的甜瓜果實線粒體通過調節能量代謝和ROS生成，在抗病啟動過程中發揮重要作用。為進一步揭示水果對病原菌感染的誘導抗性機制提供了新的視角和信息。
矽酸鈉（Si）處理降低了接種甜瓜的腐爛程度，提高了關鍵酶的能量代謝活性，使細胞內ATP保持在較高水平，同時Si還誘導了過氧化氫和超氧陰離子等線粒體活性氧（mtROS）的積累。本篇基於TMT的定量蛋白質組學分析顯示，共有24種豐度存在顯著差異的蛋白質參與能量代謝、防禦和應激反應、糖酵解和TCA循環以及氧化還原過程。本研究表明，Si處理後的甜瓜果實線粒體通過調節被病原菌感染的甜瓜的能量代謝和ROS的產生，啟動寄主對Trichothecium roseum侵染的抗性。
上海鹿明生物科技有限公司，一直專注於生命科學和生命技術領域，是國內早期開展以蛋白組和代謝組為基礎的多層組學整合實驗與分析團隊。
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參考文獻
L Lyu, Y Bi, S Li, et al. Sodium silicate prime defense responses in harvested muskmelon by regulating mitochondrial energy metabolism and reactive oxygen species production[J]. Food Chemistry, 2019, 289: 369-376.
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