論文DOI：https://doi.org/10.1038/s42003-021-01659-4
成果簡介
2021年1月29日，中國農業大學資源與環境學院孫振鈞教授課題組在Nature子刊Communications Biology發表了題為「Amynthas corticis genome reveals molecular mechanisms behind global distribution」的研究論文。該研究利用長讀段三代測序與Hi-C測序相結合的策略，組裝了高質量的蚯蚓（Amynthas corticis）基因組。通過證明蚯蚓基因組的三倍體特徵、基因組擴張、歸一化分析蛋白質表達水平和16S rDNA、加權相關網絡分析(WGCNA)以及分析基因組中防禦基因圖譜揭示蚯蚓如何調動自身基因組及其腸道微生物應對土壤環境的脅迫。
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基於長讀段三代測序與Hi-C測序相結合的策略，對皮質遠盲蚓（Amynthas corticis）基因組進行了拼裝，形成了一個長達1.2 Gb，包含42條準染色體序列的基因組。基因組所有拼裝序列的N50長度達到31 Mb，結合轉錄組測序數據共預測出29,256個蛋白質編碼基因，且91.2%的後生動物單拷貝直系同源基因都在該基因組中存在完整匹配，這些指標證明了拼裝的完整性。完整的基因組，為深入探究隱藏在蚯蚓物種獨特性背後的分子機制提供了先決條件。
引言
達爾文在晚年的時候，開啟了一段看似平淡卻又獨特的研究，研究的對象就是隱伏於地下的蚯蚓，並在1881年出版的《腐殖土的形成與蚯蚓的作用》中說:「我們很難找到其它的生靈像它們一樣，雖看似卑微，卻在世界歷史的進程中起到了如此重要的作用」。在這以後，越來越多的科學家發現蚯蚓的存在可以顯著提升土壤的肥力，降低土壤有毒物質，增加土壤微生物群落的多樣性，是土壤汙染狀況的指示生物。這個被達爾文視為卑微卻又偉大的「土壤生態系統工程師」和人類協作了幾千年，幫助人類高質量和高效地從土地獲取食物。
皮質遠盲蚓（Amynthas corticis）是一種東亞起源並通過物理傳播入侵到世界各地的廣布種蚯蚓，有研究認為該種蚯蚓的入侵性是與其獨特的基因組特徵（多倍體）和生殖方式（孤雌生殖）相關的。多倍體可以為蚯蚓提供更多用於演化或表達優勢性狀的基因組材料，而孤雌生殖則可以幫助蚯蚓更穩定地保留優良性狀。另一方面，蚯蚓與土壤及其腸道微生物存在非常緊密的互作關係，基於這種互作關係，蚯蚓可以改變土壤中各組分比例（提高土壤肥力、降低土壤土壤中的汙染物），並優化土壤微生物群落結構（提高有益菌比例、降低有毒微生物比例），也可以使自身在土壤複雜的環境中成功的生存下來。這些獨特現象的分子機制都被編碼在蚯蚓的基因組中，對其基因組的深度解析將會撩開這片神秘的面紗。
圖文導讀
首先需要回答的，是蚯蚓基因組的倍性問題。在本研究中，對若干蚯蚓個體的高深度重測序數據顯示，蚯蚓基因組中的單核苷酸多態性存在兩個頻率峰值，分別是1/3和2/3，說明蚯蚓的雙等位基因在基因組中具有三個拷貝。另外，從重測序讀段中提出的雜合k-mer序列的基因組覆蓋分布上來看，高達88%的數據支持雜合k-mer序列的總體覆蓋度是3n，而包含單核苷酸多態性k-mer序列的標準化覆蓋度是1/3，從另一個角度證明了蚯蚓的三倍體特徵。為了直接觀察到蚯蚓基因組的染色體數目，本研究進行了核型分析，發現蚯蚓具有多於120條的染色體，如此巨大的染色體數目更直觀地顯示出蚯蚓的三倍體特徵。三倍體生物在減數分裂過程中，其染色體是無法進行正常聯會的，因此該倍性特徵也支持蚯蚓的孤雌生殖方式。有意思的是，與Amynthas corticis世界廣布種不同，一些區域性分布的蚯蚓，如Eisenia fetida和Eisenia andrei，它們都是二倍體生物。這種蚯蚓基因組倍性的多樣性是否與其自然分布特徵存在一定的關聯性，還有待進一步的研究。
圖2蚯蚓基因組三倍體特性分析。a, 蚯蚓基因組單核苷酸多態性位點頻率分布。b, 蚯蚓基因組倍性最大似然法統計檢驗。c, 蚯蚓基因組雜合k-mer序列基因組覆蓋分布。d, 蚯蚓染色體核型分析。e，蚯蚓染色體數目統計。蚯蚓在具有充足基因組材料的基礎上，沿著怎樣的演化路徑加強了它應對外界環境的適應能力呢？本研究基於對物種譜系的基因家族演化分析發現，該蚯蚓為了更好的環境適應能力，走了一段與其他環節動物相比不同尋常的演化之路。首先，蚯蚓基因組的大小分別是其他環節動物海蠕蟲（Capitella teleta）的3.87倍和水蛭（Helobdella robusta）的5.49倍，說明蚯蚓的整體演化策略是基因組擴張。更奇特的是，對物種譜系中加速演化的基因家族進行相關性以及PCA分析後發現，蚯蚓與海蠕蟲以及水蛭具有很大差異，這種差異使得蚯蚓已經離開了環節動物的範疇。更細緻的分析發現，造成蚯蚓和其他環節動物巨大差異的主要驅動力是與環境適應相關基因家族的加速演化，這些基因家族的功能涉及免疫系統過程（immunesystem process），脅迫應激（responseto stress）和穩態過程（homeostaticprocess）。而且，基因家族的演化在蚯蚓內部產生了分歧，與Eisenia fetida和Eiseniaandrei相比，Amynthas corticis中與環境適應相關基因家族的演化更加劇烈。這種劇烈的演化是不是也給蚯蚓的全球分布提供了必要的遺傳基礎？
圖3 蚯蚓非比尋常的演化之路。a, 加速演化基因家族物種譜系間相關性分析。b, 加速演化基因組家族物種譜系PCA分析。c, 加速演化基因家族功能富集分析。科學家在探索蚯蚓環境適應能力背後分子機制的道路上從未停留，克隆並深入研究了很多功能性基因。蚯蚓基因組的完整拼裝，為在基因組框架下系統性地研究這些基因的分布、物種多樣性以及功能相關性提供了前提條件。本研究對蚯蚓的細胞溶解酶（包括fetidin、lysenin和coelomic cytolyticfactor），抗菌蛋白（包括lumbricin I、LBP/BPI和lysozyme），具有先天免疫功能的toll-like受體（包括mccTLR和sccTLR），氧脅迫應激蛋白（包括SOD，CAT和CRT），金屬脅迫應激蛋白（PCS），異生物質解毒蛋白（包括GST和CYP450）以及熱應激蛋白（HSP70）在基因組中進行了系統的鑑定，發現它們傾向出現在基因組倍增區域，並具有更高的基因家族擴張趨勢，這為蚯蚓適應環境提供了較為充足的分子基礎。另一方面，包含這些基因的基因組區域具有更富集的單核苷酸多態性位點，預示著這些基因具有更高的種內多樣性，使其在不同細分生境中更靈活地發揮功能，也為這些基因的持續演化提供了豐富的突變原材料。
圖4 蚯蚓在逆境中對基因組進行精準的時序調控。a, 不同時間點蚯蚓基因組高表達基因分布。b, 不同時間點蚯蚓腸道高豐度微生物分布。c, 不同時間點蚯蚓基因組高表達基因功能分布。d, 不同時間點蚯蚓腸道高豐度微生物功能分布。本研究試圖解析蚯蚓與土壤及其腸道微生物緊密互作的分子機制。為了清晰展現互作的過程，將蚯蚓培養在致病性大腸桿菌（Escherichia coliO157:H7）汙染的土壤中，然後分別在置入前和置入後3天、7天以及28天等四個時間點獲取蚯蚓的體壁及腸道微生物樣本，進行iTRAQ差異蛋白質組學鑑定以及16S rDNA測序，揭示蚯蚓如何調動自身基因組及其腸道微生物應對土壤環境的脅迫。
差異表達蛋白分析結果顯示，蚯蚓在四個時間點中都高表達了具有不同功能特徵的基因，而這些基因的功能又彼此聯繫，展現出精準的時序調控關係：在土壤汙染前，蚯蚓中高表達基因與基礎細胞功能相關，包括細胞骨架組織（cytoskeleton organization）、蛋白質運輸（protein transport）、跨膜運輸（transmembrane transport）和信號轉導（signal transduction），說明此時蚯蚓處於正常的生理狀態；致病性大腸桿菌（Escherichia coli O157:H7）汙染3天後，蚯蚓體高表達基因與防禦功能以及細胞群體行為相關，包括脅迫應激（response to stress）、免疫系統過程（immune system process）、細胞群體增殖（cell population proliferation）和細胞粘連（cell adhesion），說明此時蚯蚓已經開始動員基因組中的相關組分應對環境的脅迫，尤其是基於細胞功能的防禦機制；在置入到汙染土壤7天後，蚯蚓中高表達基因與代謝分解過程和共生過程相關，包括糖類代謝過程（carbohydrate metabolic process）、小分子代謝過程（small molecule metabolic process）、輔酶代謝過程（cofactor metabolic process）、胞源氮化合物代謝過程（cellular nitrogen compound metabolic process）、分解過程（catabolic process）和共生過程（symbiotic process），說明此時蚯蚓已經開始採用基於體液功能的防禦機制應對環境脅迫，也表明此時蚯蚓腸道微生物與蚯蚓的互作發生了增強。在置入到汙染土壤28天後，蚯蚓中高表達基因與穩態過程（homeostatic process）相關，表明在經歷了一系列應激反應後，蚯蚓已經適應了汙染土壤，並開始重新構建生物體內的穩定狀態。
圖5 蚯蚓基因組與腸道微生物互作網絡。a, 蚯蚓被置入汙染土壤前特徵性互作網絡。b, 蚯蚓被置入汙染土壤3天後特徵性互作網絡。c, 蚯蚓被置入汙染土壤7天與28天後特徵性互作網絡。d, 蚯蚓被置入汙染土壤28天後特徵性互作網絡。當基於蛋白的表達強度以及腸道微生物16SrDNA豐度構建互作網絡的時候，發現4個互作網絡均反映出在蚯蚓和蚯蚓腸道微生物之間存在較強的協同效應，共同維持著蚯蚓在不同時間點的生理需求。第一個互作網絡中，有96%的網絡組分（包括蚯蚓蛋白以及蚯蚓腸道微生物）在蚯蚓被置入汙染土壤之前具有最高的表達或豐度，功能與代謝和應激相關，顯示出蚯蚓在正常環境下的生理狀態。第二個互作網絡中，有65%的網絡組分在蚯蚓被置入汙染土壤3天後具有最高的表達或豐度，功能與免疫系統過程以及抗病性激活相關，說明這個互作網絡是蚯蚓受到致病性大腸桿菌脅迫後形成並在應對脅迫的起始過程中發揮作用。第三個互作網絡中，有95%的網絡組分在蚯蚓被置入汙染土壤7天或28天後具有最高的表達或豐度，功能與各類防禦過程、細菌素合成以及免疫功能調節相關，說明這個互作網絡在蚯蚓應對脅迫過程中發揮核心功能。第四個互作網絡中，有72%的網絡組分在蚯蚓被置入汙染土壤28天後具有最高的表達或豐度，功能與穩態過程以及生物體修復相關，表明這個互作網絡在蚯蚓應對脅迫後恢復生理機能的過程中發揮重要作用。
小結
本研究通過對蚯蚓基因組的完整拼裝與多組學分析，揭示了世界廣布種蚯蚓Amynthas corticis的三倍體特徵及其與土壤和腸道微生物緊密互作的分子機制，並為相關研究提供了豐富且多元的數據資源。基因組的解析，僅僅是撩開了這個卑微卻又偉大的「土壤生態系統工程師」神秘面紗的一個邊角，更多的奧秘還有待深入且細緻的研究來揭示。忽然想起菲爾普斯在《了不起的地下工作者》書中寫道：「如果我們對蚯蚓的態度認真起來，把腳下的土壤，而不是我們頭頂上的天空，作為我們精神的寄託和最終肉體的歸宿，我們的生命將會有怎樣的變化呢？看起來我們一直在這個問題上看錯了方向」。
主要作者介紹
通訊作者：孫振鈞，中國農業大學資源與環境學院生態科學與技術系教授、系主任、博士生導師。生態學教學名師。美國生態學會會員、國際生態工程學會會員，國際期刊《應用土壤生態學》等編委。世界蚯蚓產業聯盟（籌）主席。現已退休，任中國農業大學老科協會長。曾主持國家科技攻關、科技支撐項目，國家自然科學基礎課題、國家863課題及地方項目等研究項目27個，獲得省部級科技進步二等獎2項。出版專著7部，在國內外學術刊物或學術會議上發表論文119篇。聯繫郵箱：sun108@cau.edu.cn
第一作者：王興，博士，中國農業大學資源與環境學院副教授，博士生導師。從事動物分子生態毒理學和動物器官大小調控分子機制的研究。以第一或通訊作者（包括共同第一或共同通訊）在eLife、PNAS、Proteomics、Journal of Proteome Research、Chemosphere、Journal of Hazardous Materials、Environmental Pollution等期刊上發表SCI研究論文多篇。聯繫郵箱：swwangxing@cau.edu.cn
共同通訊作者：趙義，本科畢業於中國農業大學，獲得生物化學與分子生物學學士學位。博士畢業於北京大學，獲得生物信息學博士學位。攻讀博士期間，從事的研究包括基於高通量測序的動物胚胎DNA甲基化組圖譜研究和植物轉錄組從頭拼裝，基於比較基因組學的植物基因丟失機制研究以及基於文獻挖掘的資料庫構建，在專業領域內國際權威期刊，如Nucleic Acids Research、Molecular Biology and Evolution、BMC Evolutionary Biology等，發表文章十餘篇。就讀博士期間曾前往英國劍橋歐洲生物信息學中心實習，負責TreeFam資料庫物種樹的重構工作。
共同第一作者：張一，博士，畢業於中國農業大學生態系，主要從事蚯蚓天然免疫與腸道細菌協同免疫方面的研究。曾工作於南方科技大學環境科學與工程學院，助理研究員，研究方向為土壤生物基準；曾任工程技術創新中心項目經理，業務方向為生物堆肥與可持續農業。參與多項國家級和國際合作項目，在國內外期刊發表論文十餘篇。聯繫郵箱:zhangyi8753@126.com
共同第一作者：張玉峰，畢業於中國農業大學，獲生態學博士學位。現任廊坊師範學院科研處副處長。主要研究陸棲蚯蚓分類學、生態學及譜系地理學等問題：1）利用傳統形態方法與DNA條形碼技術對北方地區的蚯蚓進行系統分類與鑑定，構建最新的蚯蚓物種分布名錄；2）利用生物多樣性指數對研究區蚯蚓多樣性進行定量評價，從而了解該地區蚯蚓種類與數量的分布規律；3）通過分子、統計學等方法研究優勢種群遺傳多樣性，探討遺傳多樣性與土壤及其地理環境因子的相關性；4）結合地理信息系統，對北方地區蚯蚓分布格局及環境因子進行空間分析與評價。在Journal of Natural History、Zoological Systematics、European Zoological Journal、中國農業大學學報等學術期刊發表論文10餘篇。研究期間還參加了在墨西哥、上海召開的國際蚯蚓生態學大會。
共同第一作者：康明明，博士，現工作單位為中國醫科大學附屬第一醫院，助理研究員，研究方向為精準分子診斷，以第一作者在BMC Genomics、Communications Biology發表多篇論文，聯繫郵箱：kanglmf@126.com
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ES&T主編/副主編：我的論文為啥未送審就被拒稿？