此反應是不可逆的，是三羧酸循環中的限速步驟，ADP是異檸檬酸脫氫酶的激活劑，而ATP，NADH是此酶的抑制劑。
(4)第二次氧化脫羧
在α-酮戊二酸脫氫酶系作用下，α-酮戊二酸氧化脫羧生成琥珀醯CoA、NADH+H+和CO2，反應過程完全類似於丙酮酸脫氫酶系催化的氧化脫羧，屬於α氧化脫羧，氧化產生的能量中一部分儲存於琥珀醯CoA的高能硫酯鍵中。
α-酮戊二酸脫氫酶系也由三個酶(α-酮戊二酸脫羧酶、硫辛酸琥珀醯基轉移酶、二氫硫辛酸脫氫酶)和五個輔酶(TPP、硫辛酸、HSCoA、NAD+、FAD)組成。
此反應也是不可逆的。α-酮戊二酸脫氫酶複合體受ATP、GTP、NAPH和琥珀醯CoA抑制，但其不受磷酸化/去磷酸化的調控。
(5)底物磷酸化生成ATP
在琥珀酸硫激酶(succinatethiokinase)的作用下，琥珀醯CoA的硫酯鍵水解，釋放的自由能用於合成GTP，在細菌和高等生物可直接生成ATP，在哺乳動物中，先生成GTP，再生成ATP，此時，琥珀醯CoA生成琥珀酸和輔酶A。
6)琥珀酸脫氫
琥珀酸脫氫酶(succinatedehydrogenase)催化琥珀酸氧化成為延胡索酸。該酶結合在線粒體內膜上，而其他三羧酸循環的酶則都是存在線粒體基質中的，這酶含有鐵硫中心和共價結合的FAD，來自琥珀酸的電子通過FAD和鐵硫中心，然後進入電子傳遞鏈到O2，丙二酸是琥珀酸的類似物，是琥珀酸脫氫酶強有力的競爭性抑制物，所以可以阻斷三羧酸循環。