南京師範大學地理科學學院近期在農林科學一區期刊《Geoderma》上發表了pH引起的真菌豐度和組成的變化會影響人工控制pH值30天后的土壤異養硝化作用的文章。在這項研究中天昊生物有幸承擔了樣品的細菌和真菌相對定量擴增子測序和生信分析工作。在恭喜客戶又發表文章同時，我們想跟大家分享一下文章的研究思路。英文題目：pH-induced changes in fungal abundance and composition affects soil heterotrophic nitrification after 30 days of artificial pH manipulation
中文題目：pH引起的真菌豐度和組成的變化會影響人工控制pH值30天後的土壤異養硝化作用異養硝化作用廣泛發生，對酸性土壤中NO 3–的產生具有重要意義。然而，低土壤pH值是否刺激異養硝化作用尚不清楚，潛在的微生物驅動因素也不清楚。因此，在中國亞熱帶森林（森林土壤SF初始pH為4.5）和農田（農田土壤SC初始pH為5.5）土壤中，控制pH梯度（3.5、4.5、5.5、6.5、7.5）來說明土壤pH對異養硝化作用的影響。調節pH 30天後，用1% C2H2抑制自養硝化作用，通過15 N-標記實驗揭示異養硝化作用。在30天的pH調節過程中，還確定了土壤微生物特性（例如真菌和細菌的組成以及豐度），以研究異養硝化的潛在微生物驅動力。結果表明，初級異養硝化速率從pH 7.5處理的<0.3 mg N kg−1 d−1增加到pH 3.5處理中的>1 mg N kg−1 d−1，在森林土壤SF和農田土壤SC的低pH處理中，異養硝化作用對總硝化作用的貢獻率提高到60%以上。隨著土壤酸化，異養硝化過程中有機氮的使用量大於無機氮基質。真菌與初級異養硝化速率呈顯著正相關（P<0.01），與異養15N-NO3–產生對總15N-NO3–產生的貢獻呈正相關（P<0.01），說明真菌是酸性土壤中異養硝化菌的優勢菌。此外，在我們所研究的酸性土壤中，Phialocephala、Chlorium和Tararomyces可能具有異養硝化作用。本研究表明，土壤pH值的降低會影響真菌的數量和組成，進而在短期內促進異養硝化作用。異養硝化作用廣泛發生，對酸性土壤中NO 3–的產生具有重要意義。而自養硝化通常會在低pH條件下受到阻礙，因為自養硝化底物（NH3）的可用性和自養菌的活性（例如氨氧化細菌（AOB），亞硝酸鹽氧化細菌（NOB）Nitrospira和Nitrobacter）是有限的，儘管氨氧化古細菌（AOA）被認為比AOB更為豐富，並且在酸性土壤中負責自養硝化。通常，土壤pH被認為與異養硝化速率高度相關，並且與異養硝化速率呈負相關關係，進一步證明了森林，草地和耕地土壤中異養硝化速率的pH閾值（大約在pH = 6.0），在pH> 6.0時似乎可以忽略不計。然而，一些先前的研究觀察到，在pH值為3.8的森林土壤中，異養硝化速率較低（0.01 mg N kg−1 d−1），而在pH值較高（pH>6）的森林土壤中，異養硝化速率相對較高（>1 mg N kg−1 d−1）。迄今為止，土壤pH值對異養硝化速率的影響尚不清楚。此外，一些研究使用異養硝化速率與總硝化速率之比來描述土壤異養硝化過程的重要性，並觀察到該比率隨土壤pH值降低而增加。但是，異養硝化的比例很高（平均> 60％）可能是由於其在酸性條件下（平均<0.1 mg N kg−1 d−1）平行的低自養硝化速率所致，而不是表明異養硝化速率很高（平均< 0.2 mg N kg -1天-1）。此外，其他土壤變量，如土壤C含量和C:N比值，往往與pH值相互作用，並與異養硝化速率呈正相關。因此，土壤pH值對異養硝化作用的影響可能受土壤C和N含量的影響。目前還沒有證實土壤pH狀況會獨立影響異養硝化作用。因此，需要通過人工pH調控實驗來研究土壤pH對異養硝化作用的影響，部分排除土壤C、N含量的影響。土壤真菌和嗜酸細菌被認為是潛在的異養硝化菌。異養硝化菌，真菌如Basidiomycetes, Aspergillus, Penicillium, Mortierella, Trichoderma, Verticillium,，以及細菌如Arthrobacter, Paracoccus, Thiosphaera, Pseudomonas, Denitrificans等，在20世紀被分離出來，這些微生物在培養基中能從銨態氮和有機氮中產生亞硝酸鹽或硝酸鹽。一般認為，真菌在低pH條件下比其對應的細菌更有效地進行異養硝化，因為它們更耐酸。以往的研究表明，真菌能氧化土壤有機氮和銨。在酸性土壤中，氨主要轉化為銨（NH3/NH4+pKa=9.24），這是否為真菌提供了進行異養硝化作用的機會尚不清楚。了解真菌和細菌對土壤pH變化的響應及其在異養硝化作用中的作用，有助於更好地了解pH對異養硝化作用的影響。本研究通過在中國亞熱帶酸性森林（初始pH值4.5）和農田土壤（初始pH值5.5）中添加不同量的H2SO4（1M）或CaO，建立了一個pH梯度（ph3.5，ph4.5，ph5.5，ph6.5，ph7.5）來研究異養硝化速率和異養硝化菌的pH響應。我們結合C2H2抑制劑、15 N同位素示蹤技術和分子生物學方法來闡明土壤pH值對異養硝化作用的影響機理。本研究使用的土壤採集於江西省Shuangzhen Forestry Center（北緯27°59′，東經117°25′），其特徵是典型的亞熱帶氣候（年平均氣溫為18.4°C，年均1785毫米）。選擇了森林和農田兩種不同的土地類型進行土壤採樣。林地以馬尾松和杉木為主，土壤類型按美國土壤分類學分類為溼潤老成土。農田（在過去十年裡，從森林中復墾出來並獲得200-300 kg N ha−1 yr−1氮肥）種植著花生。對於每種土地類型，隨機選擇4個地塊（~4 m×4 m），移除O層（有機層）後，在每個地塊上採集一個複合表土樣品（0-20 cm）。然後將這四個複合土壤樣本匯集在一起，通過2 mm的篩子，並在4℃下儲存以進行培養實驗。森林和農田土壤樣品分別定義為森林土壤（SF）和農田土壤（SC）。SF和SC的原始土壤pH值分別為4.5和5.5；SF和SC的土壤有機碳（SOC）和全氮（TN）分別為26.64 g kg−1、1.37 g kg−1和6.47 g kg−1、0.59 g kg−1。結合15 N標記技術進行土壤pH調節，以研究人工pH調節對異養硝化作用，土壤微生物豐度和群落的影響。對於每種pH處理，準備了54個燒瓶（250 mL），然後每個燒瓶都裝有20 g新鮮土壤（以幹土重量計）。通過添加不同量的H2SO4（1 M）或CaO（表1）來調節土壤pH，使SF和SC的pH梯度分別為3.5、4.5、5.5、6.5和7.5（圖S1a）。pH調節後，所有燒瓶在25℃恆溫培養箱中培養，培養期間土壤樣品保持40%的持水量。在第0天、第15天和第30天隨機選擇三個燒瓶進行DNA提取和微生物定量，同時，在每個pH值的第1、2、3、5、7、10、15、20、25和30天，隨機選擇另外三個燒瓶，以確定土壤CO 2產生速率，在每次CO2取樣之前，用環境空氣衝洗每個燒瓶，用塞子密封6 h，然後收集37 mL氣體並注入預抽真空的小瓶中，以測量CO2濃度。然後，在每次CO2取樣後，將三個燒瓶放回培養箱中（圖S1a），培養在30天後終止，因為據報告土壤微生物組在培養30天後達到穩定的呼吸狀態，並且還立即測量每個DNA提取，以確定微生物豐度變化是否穩定。在培養結束時，隨機選擇三個燒瓶測量SF和SC組中每個pH處理的pH值（圖S1a）。在pH調節30天後，五個處理的平均pH值在SF（3.6、4.6、5.4、6.2、6.8）和SC（3.8、4.2、5.4、6.0、6.7）中呈現出梯度（表S1）。將土壤樣品（SF和SC組中每個pH處理土壤樣品的42個燒瓶）分為兩組，在黑暗中以1 KPa（1%）與添加或不添加C 2 H 2進行培養（圖S1b）。為確保自養硝化作用在測試土壤中完全被抑制，將用於C 2 H 2處理的樣品預先暴露於1 KPa（1％）的C 2 H 2中一天。然後，使用15 N標記的NO3–（以量化初級異養硝化率），15 N標記的NH 4 +和15 N標記的甘氨酸（計算在無機氮處理和有機氮處理下（無論是否使用C 2 H 2處理）的異養15NO3–生成量）一式三份進行15 N標記示蹤實驗。在1:2.5幹土水比下測定土壤pH值。使用C:N元素分析儀測定SOC和TN。使用安捷倫7890氣相色譜儀測定二氧化碳濃度。土壤溶液中NH 4 +和NO3–的濃度使用SAN Plus連續流動分析儀測定，NH 4 +和NO3–的同位素組成使用Sercon 20-22測量。使用PowerSoil® DNA Isolation Kit從0.25 g新鮮土壤中分離DNA。然後使用Real-time PCR儀器檢測以確定真菌（(ITS)1F/5.8s）、細菌（338F/518R）、氨氧化古細菌（AOA）（Arch amoAF/Arch amoAR）以及氨氧化細菌（AOB）（amoA1F/amoA2R）的豐度。經過30天的調節和培養，微生物的豐度是穩定的，然後選擇30天的DNA提取物通過真菌擴增子測序（ITS1）和細菌擴增子測序（V4-V5）來解讀微生物群落對pH調節的潛在反應。培養30天後，土壤pH調節對SF和SC的初級異養硝化速率有顯著影響（P<0.01）。在SF中，初級異養硝化速率在pH值為3.5（1.25 mg N kg−1 day−1）時最高，其次是pH值為5.5（0.57 mg N kg−1 day−1），pH值為4.5（0.48 mg N kg−1 day−1），pH值為6.5（0.41 mg N kg−1 day−1），pH值為7.5（0.21 mg N kg−1 day−1）時最低。同樣，隨著pH值的增加，SC的初級異養硝化速率顯著降低（P<0.01），在pH 3.5處理（0.85mg N kg−1 day−1）中最高，在pH 7.5（0.25mg N kg−1 day−1）中最低。結果表明，土壤pH值的降低對初級異養硝化速率有顯著的促進作用，且隨著pH值的增加，這種促進作用逐漸減弱。除pH4.5和pH7.5處理外，相同pH條件下SF的初級異養硝化速率普遍高於SC（圖1）。初級自養硝化速率也受到pH調節的顯著影響（P<0.05）（圖1）。在SF中，調節土壤（pH3.5、pH5.5、pH6.5和pH7.5）的初級自養硝化速率無顯著差異（P<0.05），顯著高於初始土壤（pH4.5）。與SF的結果不同，在SC的高pH處理中，初級自養硝化速率明顯更高（P <0.05），儘管在初始土壤（pH 5.5）中觀察到最高的自養硝化速率。土壤初級異養硝化速率與總硝化速率之比隨土壤pH值的增加而顯著降低（P<0.05），表明土壤pH值顯著降低（P<0.05）提高了土壤異養硝化作用的相對貢獻率，但不是通過抑制自養硝化作用。
圖1. SF和SC中的總硝化率以及異養和自養硝化率之比。 相同的字母表示相同土壤中不同pH處理之間無顯著差異（P> 0.05）。 SF，森林土壤； SC，農田土壤。 Hn表示初級異養硝化速率，Tn表示總硝化的總速率。一般來說，在SF和SC中，存在C 2 H 2時15 N-NO 3-的濃度低於沒有C 2 H 2時的濃度（圖S2）。在C 2 H 2存在下，15 N-甘氨酸處理產生的15 N-NO 3-一般高於15 N-NH 4+處理，除了SF（pH6.5和pH 7.5處理）和SC（pH 7.5處理）中的鹼性處理（圖S3）。在15 N-NH 4+和15 N-甘氨酸處理中，異養15 N-NO 3-產生對總15 N-NO 3-產生的貢獻分別從pH 3.5處理中的78.86％和85.10％降低至 SF的pH 7.5處理的55.97％和67.07％（圖2）。同樣，對SC的貢獻從pH 3.5處理的78.31%和88.93%下降到pH 7.5處理的54.22%和40.87%（圖2）。
圖2 在SF和SC的pH處理中，15 N-NH 4+和15 N-甘氨酸處理中，異養15 N-NO 3對土壤總15 N-NO 3產生的貢獻。字母相同表示各組間無顯著差異（P>0.05）。SF，森林土壤；SC，農田土壤。pH值調節後，細菌的種群大小隨著土壤pH的增加逐漸增加，而真菌種群對SF和SC的pH變化無響應（圖S4、S5）。在培養過程中，不同pH值下SF中真菌和細菌種群的變化有所不同；但是，培養30天後，真菌和細菌的數量變得穩定（圖S4）。在SC中，除了pH3.5處理中的細菌豐度外，在培養期間的所有pH值中真菌和細菌的數量都增加了，並且在培養30天後變得穩定（圖S5）。這些結果表明，在本次調查中，土壤微生物在培養30天後達到了穩定狀態。在pH調節30天後，真菌數量減少。在pH調節30天後，真菌數量隨著土壤pH值的增加而顯著減少（P<0.05）（圖3），而細菌數量隨著pH值的增加而顯著增加（P<0.05）（圖3）。真菌/細菌(ITS:16S)的比例最高出現在pH值為3.5的處理中，SF（平均0.23）和SC（平均0.29）都出現了這種現象（圖3），並且這種比例隨著土壤pH值的增加而顯著降低（P<0.01）。
圖3 pH調節30天後，SF和SC中土壤真菌（ITS rDNA），細菌（16S rDNA）的種群豐度以及真菌/細菌(ITS:16S)的比例。相同的字母表示該組之間無顯著差異（P> 0.05）。 SF，森林土壤； SC，農田土壤。質控後得到4531680和4331332條真菌ITS序列，以及3632742和3867433條細菌16S基因序列。重採樣後，SF中每個樣本的真菌和細菌OTU數量在567-1481和2739-6055之間，在SC中，真菌和細菌OTU的數量在256-1269和1714-7480之間。此外，所有樣本對細菌和真菌的覆蓋率分別高於95.0%和98.3%，表明本研究的測序深度足以進行多樣性分析（表S3）。ANOSIM分析表明，SF真菌群落結構（方差分析r=0.75，P<0.01）和細菌群落結構（方差分析r=0.94，P<0.01）不同pH處理間有顯著差異。PCoA分析顯示，pH 3.5處理中的真菌群落結構與SF中pH 4.5、pH 5.5、pH 6.5和pH 7.5處理的真菌群落結構有顯著差異（圖S6）。同樣，pH 3.5處理中的細菌群落結構也與SF中的其他pH處理顯著不同（圖S6）。ANOSIM分析表明，在SC中，不同pH處理的真菌群落結構差異顯著（ANOSIM統計r=0.68，P<0.01）。PCoA分析顯示，pH 3.5和pH 7.5處理的真菌群落結構與pH 4.5、pH 5.5和pH 6.5處理的真菌群落結構有顯著差異（圖S7）。五種pH處理的細菌群落結構差異很大（圖S7），ANOSIM分析結果證實了這一點（ANOSIM統計r=0.94，P<0.01）經過30天的pH調節，在SF和SC中真菌（圖4）和細菌群落（圖S8）在屬到科水平上發生顯著變化。在SF中，SIMPER分析顯示，Phialocephala、Mortiella、Geminibasidium分別貢獻了各pH處理間真菌群落的Bray-Curtis總差異的6%，5%和1%（表S4）。土壤酸化顯著降低了Mortierella、Trichoderma、Geminibasidium的相對豐度（P<0.05），同時顯著增加了Phialocephala的豐度（P<0.05）。Chloridium和Penicillium只在ph3.5、ph4.5、ph6.5和ph7.5處理中出現，儘管它們在真菌群落中所佔比例很低。Indicator分析還表明，在pH6.5和pH7.5處理中，Penicillium是最豐富的屬（表S5）。根據SC的SIMPER分析，真菌屬Exophiala排名第一，佔各pH處理間Bray-Curtis總差異的8%，其次是Ceratobasidium（2%）、Acidomelania（2%）、Tararomyces（2%）、Chaetomium（2%）、Coniochaeta（1%）、Articulospora（1%）和Mortierella (1%)（表S6）。在SC中，Exophiala最為豐富，其在ph4.5和ph5.5處理中所佔比例均大於50%（圖4）。SC中Mortierella的豐度隨土壤酸化而降低，這與SF一致（圖4）。此外Ceratobasidium、Acidomelania、Talaromyces僅在酸性土壤（pH 3.5、pH 4.5、pH 5.5）中大量存在（圖4），這與Indicator分析（表S7）一致。
圖4 SF和SC中優勢真菌屬的相對豐度。SF，森林土壤； SC，農田土壤。土壤初級異養硝化速率與15 N-NO 3-產生及微生物豐度的關係在SF和SC中，在15 N-NH 4+（P <0.01）和15 N-甘氨酸（P <0.05）處理中，初級異養硝化率與異養15 N-NO 3-產量對總15 N-NO 3-產量的貢獻呈顯著正相關（圖5）。在15 N-NH 4+（r=0.40，P<0.05）和15 N-甘氨酸（r=0.55，P<0.05）處理中，土壤真菌數量與初級異養硝化速率（r=0.88，P<0.01）以及異養15 N-NO 3-產生對總15 N-NO 3-的貢獻呈顯著正相關。此外，真菌/細菌的比值與土壤初級異養硝化速率呈顯著正相關（r=0.83，P<0.01），在15 N-NH 4+（r=0.46，P<0.05）和15 N-甘氨酸（r=0.55，P<0.01）處理中也表現出顯著的正相關。土壤細菌數量與土壤異養硝化作用和異養NO 3-產生率無顯著相關性（P>0.05）。就真菌屬而言，在土壤中，Phialocephala（r=0.98，P<0.01）、Chloridium (r = 0.91, P < 0.05) 和Tararomyces (r = 0.86, P < 0.05)的相對豐度也與SF和SC土壤初級異養硝化速率呈顯著正相關。
圖5 在15 N-NH 4+（a）和15 N-甘氨酸（b）標記處理中，土壤初級異養硝化速率與異養15 N-NO 3-產量對總15 N-NO 3-產量的貢獻之間的關係。天昊微生物項目文章：紅曲菌發酵的蕎麥通過調節肝臟代謝物和腸道微生物來預防血脂異常和非酒精性脂肪肝；
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