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神經突觸是大腦中眾多神經元之間信息傳遞和存儲的最基本的結構與功能單元。突觸的異常則可能是導致如抑鬱症和阿爾茨海默病等精神與神經疾病的起源。精確解析突觸的蛋白分子結構和組織架構、及其在神經活動或異常過程中的變化是解密大腦奧妙的一個關鍵環節，也是腦科學與腦疾病研究中最基礎的核心研究方向之一。由於缺乏有效的研究手段，神經突觸在很大程度上仍舊是一個「黑盒子」。冷凍電鏡（CryoEM）技術的快速發展，一方面使得眾多通過分離純化後的蛋白質等生物大分子近原子分辨三維結構得以解析，另一方面，基於最新的冷凍電鏡斷層三維成像技術（CryoET）能夠對保存在近生理狀態下細胞和組織樣本進行納米解析度的三維成像，為在神經突觸及其它細胞區室中原位解析蛋白質分子結構和組織架構帶來了新的契機。
2020年11月2日，中國科學技術大學、中國科學院深圳先進技術研究院雙聘教授畢國強和劉北明團隊，與美國加州大學洛杉磯分校周正洪教授合作在Nature Neuroscience雜誌上發表文章Mesophasic organization of GABAA receptors in hippocampal inhibitory synapses，通過發展前沿冷凍電鏡斷層三維成像技術，首次解析了抑制性突觸中GABAA受體的原位三維結構，並闡釋了GABAA受體和支架蛋白在抑制性突觸中具有層級化的介態相分離的組織規則。
畢國強教授多年來著重於發展用於突觸、神經網絡及全腦尺度解析的前沿顯微成像技術，自從2007年回國後，核心工作之一即是與周正洪教授和匹茲堡大學章佩君教授開展合作，發展CryoET原位三維成像技術，重點應用於突觸結構與功能研究。畢國強教授與張小康、陶長路、劉雲濤等學生一起，經過長達十年的艱苦攻關，研發了新型冷凍光電關聯顯微成像技術，在國際上開創性地開展了基於冷凍電鏡與關聯顯微成像技術的神經突觸超微結構與功能研究，首次利用CryoET解析了完整神經突觸的三維結構，並實現了對中樞神經系統中兩類最主要突觸-興奮性與抑制性突觸的精確區分以及結構特徵的定量化分析【1-4】。
圖1. 冷凍電鏡斷層原位成像技術解析神經突觸受體蛋白原位結構與組織分布
在此基礎上，研究團隊發展了一種基於過採樣與自動分類的冷凍電鏡斷層三維成像亞區域圖像處理方法，實現了對細胞斷層三維重構圖像中無標記和無模板依賴的蛋白質自動識別和三維重構分析。基於這一方法，研究團隊實現了對抑制性突觸中GABAA受體的自動化識別並解析了其19Å解析度的原位三維結構，這是目前已報導的首個突觸原位受體蛋白結構。進一步，通過對GABAA受體在突觸中的空間分布進行分析，發現這些受體在抑制性突觸中呈現層級狀的組織分布特性：GABAA受體之間可以形成具有距離固定（11nm間距）而相對角度可變的雙分子複合物；這種雙分子複合物進一步組成具有較低熵並且具備自組織特性的二維網絡；最後形成具有清晰邊界並介於固、液之間的「介態」相分離狀態（mesophasic organization）。通過對GABAA受體的對應的胞內區域進行局部亞區域分類與平均分析和Monte-Carlo模擬分析表明，受體蛋白的這種組織形式可以通過突觸後支架蛋白和受體之間的靈活相互作用而形成。
圖2. 抑制性突觸中受體等蛋白分子、細胞器等超微結構的三維可視化(圖片版權：陶長路、劉雲濤、畢國強；圖片製作：王國燕、馬燕兵)
受體分子與支架蛋白的這種半穩定性組織分布特徵，否定了早期關於抑制性突觸中受體蛋白規則錨定在支架蛋白所形成穩定的六邊形網格上的推測；另一方面，GABAA受體在相分離邊界內相對均勻分布的特性，也不同於基於超分辨光學成像所發現的興奮性突觸中受體蛋白具有局部納米域分布的特性。抑制性突觸中受體分子與支架蛋白的這種介態自組織形式，使得突觸同時具備了穩定性和可變性，這一特性從分子組織結構層面很好地解釋了學習與記憶的突觸機理。
本研究中， GABAA受體原位三維結構的首次解析，為受體蛋白原位高分辨解析以及相應藥物作用機理和治療藥物開發研究奠定了基礎；對抑制性突觸分子組織架構的解析表明利用冷凍電鏡斷層成像技術對突觸這一「黑匣子」的解密邁出了關鍵的一步。
本論文共同第一作者為中國科學技術大學博士生劉雲濤（現美國加州大學洛杉磯分校博士後）、博士後陶長路（現中科院深圳先進技術研究院副研究員）和中科院深圳先進技術研究院正高級工程師張小康，通訊作者為劉北明教授、周正洪教授和畢國強教授。江蘇大學夏文君副教授完成了其中數學建模和計算模擬工作。畢國強教授領銜的團隊依託中國科大合肥微尺度國家研究中心與中科院深圳先進院成立的腦信息研究中心現招聘博士後、研究助理和研究生（包括客座學生），詳見文末。
專家點評
張明傑（香港科技大學，中國科學院院士）
突觸信號的高效傳遞依賴於突觸後膜緻密區（PSD）獨特的構架和複雜的分子組成。畢國強團隊和周正洪團隊再次聯手利用冷凍電子斷層成像（CryoET）技術，在神經突觸原位觀察到緻密區中受體和支架蛋白的組織方式，並提供了精準的GABAA受體的結構信息和分布特徵 。通過分析膜上受體的分布，該研究進一步指出在抑制性突觸後膜，GABAA受體形成一種有明顯界面的聚集體錨定在突觸後膜上，這種自組裝的GABAA受體聚集體介於無序的液態和完全有序的固態之間，和通過液-液相變而形成的聚集體非常吻合。非常有意思的是GABAA受體聚集體所在的膜下面有一層～5納米厚的緻密層，作者認為該緻密層可能是由支架蛋白gephyrin聚合而成，進而一個由GABAA受體和支架蛋白相互作用、通過液-液相變而形成抑制性突觸後膜緻密區（iPSD）的模型躍然紙上。這種通過相變自組裝方式能使膜上受體相對穩定地集中在緻密區並具有一定的可塑性。
關於相分離的研究是近年來的熱點，然而對其生物學意義的解答卻受限於複雜而模糊的分子機制，很多領域更是缺乏直接的體內證據，劉、周、畢團隊的工作非常直觀地呈現了iPSD在神經突觸原位存在的方式和形成的機制。無獨有偶張明傑課題組同日在Cell Research雜誌上發表的關於抑制性突觸後膜緻密區（iPSD）中GlyR/GABAA受體與支架蛋白gephyrin相分離研究的發現和劉、周、畢團隊的電鏡觀察結果高度吻合，兩個完全獨立的研究相輔相成、從不同的角度共同揭示了iPSD形成的模式及對膜上受體的動態富集機制。長久以來，關於PSD的研究多集中於興奮性突觸，而對抑制性突觸知之甚少。劉、周、畢團隊的工作除了為iPSD形成機制的研究提供了關鍵的結構基礎，同時也為相分離現象的解析建立了新的技術手段。
專家點評
竺淑佳（中國科學院腦科學與智能技術卓越創新中心）
離子通道廣泛表達在神經突觸膜上，是神經信號快速傳遞的重要物質基礎。解析原子/分子解析度的關鍵離子通道超微結構一直是神經生物學的前沿熱點。目前最普遍是利用純化的重組蛋白，採用冷凍電鏡單顆粒成像技術SPA（Single Particle Analysis），可實現3-5 Å解析度。鑑於離子通道組裝及構象的多樣性、組織制樣的複雜性，用透射電鏡看到原位組織離子通道的超微結構依然困難重重。本研究中，中科大畢國強教授、Pak-Ming Lau教授和UCLA周正洪（Z.Hong Zhou）教授合作，利用冷凍電鏡斷層成像技術Cryo-ET（Cryo-Electron Tomography）與光電聯合技術的結合，通過對培養海馬神經元上抑制性突觸超微結構的精細分析，以比超高分辨光學成像更高一個數量級的19 Å解析度，成功「正視」了GABAA受體在原位突觸後膜上的三維結構。他們進一步分析了GABAA受體在突觸膜表面的聚集形式、分布網絡、與突觸後膜支架蛋白相互作用、及與突觸前囊泡釋放之間潛在的偶聯機制。希望畢國強教授團隊能將開發的方法應用到更多神經系統（包括興奮性）離子通道結構的原位解析中，為生理或病理狀態下離子通道的功能及藥理學驗證提供理論基礎。值得一提的是，Nature在10月份報導了由英國MRC實驗室Radu Aricescu和Sjors Scheres教授合作發表的SPA突破性工作，其中將GABAA受體解析到1.7 Å的超高解析度【5】。期待在不久的將來，離子通道的研究將SPA、cryo-ET及功能驗證有效整合起來，為突觸傳遞及可塑性的分子機制提供原子解析度的證據。
專家點評
李賽（清華大學生命學院研究員，長期從事高分辨冷凍電鏡斷層成像及囊膜病毒結構生物學相關研究）
PSD（Postsynaptic density，突觸後緻密區）位於突觸後膜，是神經突觸的重要組成部分。PSD被認為是在突觸後膜集中和組織神經遞質受體的超級結構。PSD也用作信號裝置，例如，PSD中的激酶和磷酸酶被激活並從PSD中釋放出來，從而改變位於樹突棘中蛋白質的活性，或者被運送到細胞核來影響蛋白質的合成。PSD行使著快速、非對稱的信號傳遞功能。由於該區域匯集了上百種蛋白，在電鏡下，PSD的密度較為明顯，直徑大約為250-500 納米，厚度大約為25-50納米。
針對PSD上蛋白組分、功能、結構、分布，及PSD本身形態的研究一直是神經生物學的熱點。然而，由於PSD的多形性，以及其上蛋白尺寸較小，對其的高分辨成像及結構解析工作一直是個難點。超分辨螢光顯微鏡提供了良好的蛋白定位，但通常只能達到20nm左右的定位精度，加上螢光標記效率的問題仍舊無法達到定量解析PSD的要求；冷凍電鏡可提供高分辨的成像，但由於缺乏特異性標記手段，又難以分辨PSD上面的蛋白分子。因此，解開PSD的謎題，還需要在冷凍電鏡方法上有所創新。
A型GABA受體來自配體門控離子通道超級家族，呈現五聚，並以20根穿膜的a-helix錨定在細胞膜上。人源的GABAA受體的五個亞基一般由兩個a基因、兩個b基因及一個g基因編碼，互相結構稍有不同。首個GABAA受體的五聚體結構在2014年由筆者當時在牛津大學結構生物學部的同事Paul Miller和A. Radu Aricescu通過晶體學方法解析至3 Å 【6】。為獲得穩定的GABAA受體五聚體複合物及晶體，Radu幾乎孤注一擲，集中幾乎所有的資源攻關。經歷反覆的失敗並耗盡了所有的經費後，終於迎來柳暗花明，該晶體結構當時在神經生物學屆引發了轟動。那一年也是冷凍電鏡革命的開始。此後，Radu迅速向單顆粒冷凍電鏡技術轉型，並將課題組遷去劍橋LMB。在那裡，他一發不可收拾，使用冷凍電鏡解析了GABAA受體的一系列結構並在頂尖刊物發表【7,8】。他更是與Relion作者Scheres合作，使用冷凍電鏡單顆粒法將GABAA受體的結構推到了1.7 Å的驚人解析度，作為方法學突破成果發表在今年10月的Nature上【5】。
經歷了晶體學到冷凍電鏡的轉換，GABAA受體複合物結構被愈發快速的解析，但這些結構均來源於體外表達的重組蛋白，人們對於它在神經突觸上的原位結構、分布情況、互作關係等信息仍然知之甚少。中國科學技術大學畢國強團隊與加州大學洛杉磯分校周正洪團隊合作，開創性的使用冷凍電鏡斷層成像技術（cryo-ET）及子斷層圖像平均法（STA）對完整突觸中的PSD區域進行高分辨三維成像及結構解析，成果揭示了PSD的形態，並在該區域確認了GABAAR的19Å解析度結構及分布。
在該項目中，作者們從大鼠胚胎取得海馬體，並在體外培養。作者們將細胞在金網上生長後使用投入式冷凍裝置制樣，並分別在使用VPP或無VPP的情況下對突觸區域進行cryo-ET數據採集。為分辨不同類型突觸PSD結構，作者們進行了光電聯合成像，並確認在冷凍電鏡下採集的其中一類為抑制性突觸的PSD結構。
在觀察這些tomogram數據的時候，作者們發現大量的五聚體密度，疑似為GABAAR。於是項目解析目標進一步明確為解析GABAAR的原位結構與分布。為準確找到這些GABAAR，作者們對PSD所在的突觸後膜進行了細胞膜的建模以確認細胞膜的取向。隨後，他們在膜的模型上種下「種子」，並保證這些種子的數量遠遠超過GABAAR的數量，通過這種過採樣方法，絕大多數GABAAR有望被找到。接著，作者們使用Relion對圍繞這些種子切下的子斷層圖像進行了仔細的分類和對齊計算，再利用膜的已知幾何特徵，對重疊或計算失誤的子斷層圖像進行清除，並最終獲得GABAAR的19Å解析度原位結構。通過對一系列已知GABAAR體外重組結構的比對，該cryo-ET結構被認為和GABAAR-b3的結構【6】最為近似。
在獲得原位結構後，作者們進一步對GABAAR在PSD的原位分布進行了分析。在計算GABAAR的相對位置後，鄰近的GABAAR被發現以11 nm的典型距離間隔。並以GABAAR pair為基本單元組裝成較為鬆散的網絡分布在PSD上，並呈現分明的邊界。作者們進一步推斷，這些GABAAR形成的網絡可能與突觸後的支架蛋白及其他受體有相互作用，並與突觸前的囊泡釋放位點對齊。
GABA受體的結構一直是結構生物學、神經生物學和膜蛋白研究的熱點。自2014年使用晶體學解析首個GABAAR結構，到當年迎來的冷凍電鏡革命推動整個GABAAR結構生物學領域向冷凍電鏡轉型，到如今畢國強團隊與周正洪團隊結合冷凍電鏡斷層成像技術（cryo-ET）及子斷層圖像平均法（STA）揭示其原位結構。結構生物學技術的更新與發展趨勢，從這6年間發表的GABAAR結構歷程中可見一斑。當結構生物學屆不再僅僅滿足於體外重組蛋白的高分辨信息，而更渴望獲得它們在原生環境下的全長天然結構及地理分布時，cryo-ET及STA 成為回答這些問題的主要高分辨手段。cryo-ET被應用在結構生物學中，可以回答很多獨一無二的生物學問題，在筆者看來最吸引人的有四個：1）它帶來豐富的、納米級解析度的生物背景(context)。比如生物大分子在原生環境中的拷貝數、分布規律、與其他分子的互作；2）它展示天然、原位的生物結構；3）它的三維原始數據特點為解析在體外難以重組表達的超大分子複合物帶來可能；4）結合光電聯合、聚焦離子束減薄等技術，它可以實現跨尺度高分辨成像，甚至可以從生物組織中獲得納米級解析度三維信息。由於應用前景廣闊，可拓展空間巨大，cryo-ET被譽為結構生物學的未來技術方向。然而，該方向技術分支較多、學習路線漫長、眾多軟硬體不夠成熟，讓眾多即使有冷凍電鏡積澱的初學者也淺嘗輒止、望而卻步。這篇文章的方法討論部分篇幅詳細，解答的生物問題新穎性較強，這展示著，畢國強團隊與周正洪團隊可謂是當之無愧的結構生物學先驅者。
【注，恰逢本文發表之際，李賽老師關於cryo-ET的科普綜述文章在微信公眾號「返樸」發表，李賽老師對cryo-ET技術的原理、發展歷史與未來趨勢有著非常深入獨到的解讀，詳見：】
原文連結：
https://www.nature.com/articles/s41593-020-00729-w
參考文獻
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2. Tao, C. L., et al. (2018). "Accumulation of Dense Core Vesicles in Hippocampal Synapses Following Chronic Inactivity." Front Neuroanat 12: 48.
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6. Miller, P.S., and Aricescu, A.R. (2014). Crystal structure of a human GABAA receptor. Nature 512, 270-275.
7. Laverty, D., Desai, R., Uchanski, T., Masiulis, S., Stec, W.J., Malinauskas, T., Zivanov, J., Pardon, E., Steyaert, J., Miller, K.W., et al. (2019). Cryo-EM structure of the human alpha1beta3gamma2 GABAA receptor in a lipid bilayer. Nature 565, 516-520.
8. Masiulis, S., Desai, R., Uchanski, T., Serna Martin, I., Laverty, D., Karia, D., Malinauskas, T., Zivanov, J., Pardon, E., Kotecha, A., et al. (2019). GABAA receptor signalling mechanisms revealed by structural pharmacology. Nature 565, 454-459.
來源：BioArt
1980-2020
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原標題：《【學術前沿】畢國強團隊利用冷凍電鏡原位成像揭示抑制性突觸受體組織分布規則》
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