引言
2020年註定是不平凡的一年，也將是載入史冊的一年。一個不太熱門的研究，一下子進入了公眾視野，給我們上了一堂沉重的課。那麼如何有效防範病毒傳播，如何進行專業防控和疫苗研發，這都需要對病毒基本特徵和機理深入研究。
然而，由於受到光學衍射極限的限制，普通光學顯微鏡解析度只能達到200nm，而通常病毒和亞細胞結構的尺寸只有幾十到200多納米，遠遠小於普通光鏡的解析度。超高分辨顯微技術的出現，為觀測這類精細結構提供了可能，因此也得到了越來越廣泛的應用。作為超高分辨技術的先驅，受激發射損耗（STimulated Emission Depletion, STED）技術更是在生命科學領域尤其是病毒學相關研究中發揮著重要作用。
本次為大家分享STED技術在病毒學研究中的應用和新進展，助力生命科學研究和發展。
STED基本原理
2014年諾貝爾化學獎授予三位科學家，以表彰他們發明超高分辨顯微技術。其中Stefan Hell發明了STED技術，而徠卡公司也是第一個將其商業化。從2007年開始，徠卡STED產品不斷創新和優化，已經擁有近13年的STED技術積累。2014年首次推出SP8 STED 3X，即榮獲當年的R&D100大獎。2019年更是創新性的推出了τ-STED，進一步在提升解析度的同時降低了雷射功率，更適合活細胞超高分辨成像。
2014年諾貝爾化學獎獲得者，左起分別是：Eric Betzig、Stefan W. Hell、William E. Moerner
說了這麼多，STED技術原理到底是什麼呢？很簡單。我們想像一下，一個點發射出的螢光信號，被檢測後通常是一個衍射斑；如果我們同時使用一個甜甜圈樣的雷射將其周圍的信號擦除掉，只允許中心很小的螢光信號發射出來，這樣解析度不就提高了嗎。這個起擦除作用的雷射便是STED雷射，也叫損耗光，利用的是螢光的受激發射損耗原理。之後，通過對圖像的掃描，即可直接呈現超高分辨圖像，無需任何後續計算過程。同時，根據公式，可通過增加STED雷射功率來提升圖像解析度。
STED原理示意圖：STED通過受激發射損耗去除衍射環上的螢光信號，大大縮小有效的激發區域，從而改寫了解析度公式，提高了光學解析度
STED技術在病毒學研究中的應用實例
01
第一個應用實例，是對病毒精細結構的觀察。2012年發表在國際頂級期刊science上，標題為：螢光納米顯微鏡（STED）揭示成熟依賴的HIV-1病毒表面蛋白的再分布特徵【1】。
圖中綠色代表HIV-1病毒粒子，紅色表示病毒表面的膜蛋白。可以看到，通過普通共聚焦無法分辨膜蛋白的具體定位位置，很模糊。包膜糖蛋白gp120（紅色）與病毒粒子（綠色）90%共定位，信號模糊，分辨不出細節。而STED成像可以發現，大多數成熟病毒粒子表現出單一的包膜蛋白Env信號或焦點(圖1B)，而大多數未成熟粒子表現出兩個或兩個以上的包膜蛋白Env信號(圖1D)。
02
第二個應用實例，是對病毒成熟過程的觀察。標題為：STED納米顯微鏡揭示HIV病毒蛋白水解成熟的時間過程【2】。
利用STED顯微鏡發現在HIV-1病毒成熟和未成熟條件下，可非常清晰區分其Gag蛋白的不同結構特徵。未成熟病毒的Gag蛋白呈中空環狀（圖a），而成熟病毒中呈實心固縮狀（圖b）。
作者巧妙的利用光控方法，進行STED時間序列成像。在400nm紫外光照後，PDI（光催化降解的蛋白酶抑制劑）降解，Gag蛋白能夠被蛋白酶水解切割，進而病毒成熟。STED時間序列成像可輕鬆捕獲病毒從未成熟到成熟過程，Gag蛋白重排的結構變化過程。
03
第三個應用實例，是對病毒基因組示蹤。標題為：以單分子解析度示蹤宿主細胞中的病毒基因組【3】。
腺病毒DNA通過AF594標記的疊氮點擊反應顯示，衣殼蛋白通過抗hexon的抗體識別，並且只有在脫殼後，病毒DNA才可以被反應檢測到螢光信號。
通過gated STED超高分辨顯微成像，可顯著提高解析度，清晰呈現病毒衣殼和DNA的真實尺寸大小。腺病毒衣殼實際大小約80nm，gSTED顯示約110nm（包含一二抗尺寸），與實際一致。gSTED顯示被衣殼蛋白包裹的病毒DNA尺寸略小於80nm，也與衣殼尺寸符合。
04
第四個應用實例，是對病毒基因組複製的觀察。標題為：利用STED超高分辨顯微鏡觀察複製的HSV-1病毒【4】。值得一提的是，本文由中科院昆明動物所周巨民老師課題組與徠卡公司合作完成。
病毒基因組複製是單純皰疹病毒 1 (HSV-1) 溶解感染周期的重要事件。目前由於檢測和觀察方法的局限，病毒複製過程的細節仍難以捕捉。為了獲得更加詳細的 HSV-1 複製機制，本文使用了STED受激發射損耗顯微鏡，結合螢光原位雜交 (FISH) 和免疫螢光，對HSV-1 複製過程進行了精細觀察。
作者設計了位於HSV-1病毒基因組兩端的探針，分別以DIG（綠色）和Biotin（紅色）進行標記，在病毒複製的早期和晚期，分別成像觀察。STED成像發現，在複製的早期，紅綠兩色信號的共定位程度較高；而在複製後期，兩個係數均發生了明顯降低，表明HSV-1 基因組在複製過程中經歷了從緊湊到鬆弛的動態結構變化，同時需要佔用較大的空間進行複製。
05
第五個應用實例，是對病毒侵染和傳播過程捕獲的研究。標題為：ARP2和病毒誘導的絲狀偽足促進了人類呼吸道合胞體病毒的傳播【5】。
利用STED超高分辨顯微鏡進行成像，發現感染了RSV病毒的細胞（圖A第一行，標記為A和C）外存在大量的絲狀偽足（紅色），且富集有大量病毒顆粒（綠色）；暗示可通過絲狀偽足將RSV病毒傳遞給鄰近細胞。而在ARP2敲除的細胞中（圖A第二行），即便感染了RSV病毒，細胞的絲狀偽足數量都大量減少，病毒在細胞間的傳播不明顯。放大圖像（圖B），可觀察到RSV病毒主要分布在絲狀偽足的尖端，進一步驗證了病毒可通過誘導絲狀偽足的產生來促進其在細胞間的傳播。
如何進一步提高STED解析度？
根據公式我們可以知道，通過增加STED雷射功率就可直接增加圖像的解析度，這個方法最為簡單；但問題是不利於活細胞成像。那麼如何在不提高雷射功率的前提下，進一步提高STED解析度呢？有以下三種方法，分別是gated STED，gated STED + Lightning，和徠卡新推出的τ-STED。
01
以兩個距離76nm的DNA Origami為例，gated STED在不改變STED雷射功率的前提下，逐步縮小螢光壽命的檢測範圍，可逐步提高解析度，清晰地分辨兩個點信號。
對中心粒的gated STED + Lightning成像結果，解析度（半高寬）可達22nm！
新一代STED：τ-STED，即將STED和超快速的螢光壽命相結合，實時呈現超高清分辨圖像。它在已有STED優勢的基礎上，可以更低雷射功率獲得更高圖像解析度，進一步拓展螢光染料的選擇，非常適合長時間的活細胞成像。
徠卡STED擁有13年的研發、技術和服務經驗，也具有以下突出優勢特點，是病毒學研究的絕佳利器：
此外，整個STED是搭載在徠卡共聚焦平臺上的，因此也擁有共聚焦的所有優點。相信徠卡STED超高分辨顯微鏡能夠更多地貢獻超高清圖像結果，助力病毒學和生命科學研究發展。
參考文獻：【1】Chojnacki J, Staudt T, Glass B, et al. Maturation-dependent HIV-1 surface protein redistribution revealed by fluorescence nanoscopy.[J]. Science, 2012, 338(6106): 524-528.
【2】Hanne J, Gottfert F, Schimer J, et al. Stimulated Emission Depletion Nanoscopy Reveals Time-Course of Human Immunodeficiency Virus Proteolytic Maturation[J]. ACS Nano, 2016, 10(9): 8215-8222.
【3】Wang IH, Suomalainen M, Andriasyan V, et al. Tracking viral genomes in host cells at single-molecule resolution. Cell Host Microbe. 2013;14(4):468–480.
【4】Li Z, Fang C, Su Y, et al. Visualizing the replicating HSV-1 virus using STED super-resolution microscopy[J]. Virology Journal, 2016, 13(1): 65-65.
【5】Mehedi M, Mccarty T, Martin S E, et al. Actin-Related Protein 2 (ARP2) and Virus-Induced Filopodia Facilitate Human Respiratory Syncytial Virus Spread[J]. PLOS Pathogens, 2016, 12(12).