適體是通過配體的體外系統進化通過指數富集（SELEX）分離篩選出來的核酸，它們作為出色的生物識別元件而受到廣泛關注。已經開發出了基於適體來檢測多種目標，尤其是小分子。小分子結合適體後會引發適體的結構變化，從而產生比色，螢光或電化學的信號。但是，大多數SELEX方法使用非結構化庫，因此會產生適體具有不可預測的綁定域，並且沒有結構切換功能。因此，通常需要額外的工程步驟來將結構切換功能引入此類適體。常用的方法是將適體截短以確定其靶標結合域，為了檢測到這種變化，截斷的適配體必須用信號報告元素進行化學修飾，如螢光團、電活性標記、酶或量子點。這使得這種傳感策略複雜且昂貴，而且適配體的不穩定會大大降低其與靶結合的親和力。
2018年，美國佛羅裡達國際大學的Yi Xiao課題組和福州大學的付鳳富教授在《J. Am. Chem. Soc.》雜誌上發表了一篇題為「No Structure-Switching Required: A Generalizable Exonuclease-Mediated Aptamer-Based Assay for Small-Molecule Detection」的研究論文。作者開發了一種簡單的雙核酸外切酶介導的測定方法，該方法通常可以在未修飾的，預摺疊的條件下檢測小分子。對脫氫異雄甾酮-3-硫酸鹽（DIS）及脫氫異雄甾酮-3-硫酸鹽適體進行了詳細研究，並用ATP和古柯鹼進行了驗證了其工作機制。最後，在實際樣品進行了回收率測定並構建了同時檢測ATP和古柯鹼的雙重傳感器。
圖1. 有無DIS時，適配體(DIS-37)被Exo III酶解的過程。（A）DIS-37的寡核苷酸結構。（B）有無250 μM DIS的情況下在60分鐘內對DIS-37消化產物進行PAGE分析。（C）Exo III介導的非靶標結合（左）和靶標結合（右）DIS-37消化的示意圖。
無論DIS是否存在，Exo III都會從DIS-37的3'末端迅速消化前三個核苷酸。在沒有DIS的情況下，Exo III繼續消化，形成了三種中間產物（33 nt，32 nt和31 nt），最終產生了30nt的主要產物（圖1B）。在存在DIS的情況下，抑制了Exo III的進一步消化，主要產物為33 nt和34 nt（圖1和1C）。這些結果表明，加入靶標後，DIS-37的Exo III消化受到強烈抑制。
圖2. 有無250 μM DIS的情況下，核酸外切酶消化15分鐘後，DIS-30和DIS-34的PAGE分析。（A）DIS-30和（B）DIS-34的核酸外切酶消化產物的寡核苷酸結構和PAGE分析。DIS-37的Exo III消化是通過兩階段過程發生的。
之前實驗表明，在靶標存在下，34-nt產物極大地抑制了Exo III的消化。為了了解抑制的機理，作者用Exo III或Exo I消化了DIS-30和DIS-34。無論是否存在靶標，DIS-30都不被Exo III消化，而是被Exo I完全消化（圖2）。這證實了即使在250μM DIS的存在下，30 nt產物也主要以單鏈狀態存在。在沒有靶標的情況下，Exo III和Exo I均可消化DIS-34（圖2B），這表明非靶標結合的DIS-34在單鏈和雙鏈狀態之間處於平衡狀態。相反，由於存在靶標，在存在DIS的情況下，DIS-34的Exo III消化受到極大抑制，適體複雜。同樣，目標結合的DIS-34也未被Exo I消化，表明適體是主要在雙鏈狀態時結合到DIS（圖2B）。
圖3. 15分鐘後，DIS濃度增加時，（A）DIS-37和（B）其突變體（DIS-37-M）的核酸外切酶消化PAGE分析。適體用Exo III和Exo I的混合物進行消化，然後用PAGE分析來表徵消化產物。（C）DIS-37和DIS-37-M所有消化產物的計算濃度（基於DNA階梯強度）與DIS濃度的校準曲線。
基於這些結果，作者開發了一種雙核酸外切酶介導的測定方法，該方法利用Exo III和Exo I的協同消化來定量DIS濃度。在存在DIS的情況下，Exo III僅從DIS-37去除3個核苷酸，而與靶標結合的34 nt產物仍然對兩種核酸外切酶具有抗消化能力。該消化實驗的PAGE分析證實DIS-37在不存在靶標的情況下被完全消化。在存在目標的情況下，觀察到了34 nt的主要產物，圖3A和3C）。為了確定更高濃度的DIS是否可能抑制任一核酸外切酶的活性，作者用核酸外切酶混合物消化了該突變體適體DIS-37-M。突變體在高達500 μM的DIS濃度下被完全消化（圖3B和3C），證實DIS本身既不抑制Exo III也不抑制Exo I。
圖4. 使用無標籤的基於適體的雙核酸外切酶介導的螢光分析檢測DIS。（A）使用SYBR Gold作為信號報告基因的DIS檢測測定的方案。（B）有無250 μM DIS的情況下，經核酸外切酶混合處理的（紅色和黑色線）和未經處理的（藍色線）DIS-37的SYBR Gold的螢光光譜。（C）在各種DIS濃度下產生的樣品的螢光光譜。（D）從螢光光譜得出的校準曲線。（E）在緩衝液以及50％尿液中測定的線性範圍。
作者將雙核酸外切酶抑制方法改編為無標記的基於螢光的測定法，用於DIS的靈敏檢測。選擇SYBR Gold作為信號報告基因，因為它僅對寡核苷酸螢光染色。用核酸外切酶混合物消化DIS-37 15分鐘後，添加含有EDTA和甲醯胺的溶液以使核酸外切酶失活並將所有主要產物變性為單鏈結構。加入SYBR Gold後，相對於不含靶標的樣品，觀察到含有250 μM DIS的樣品的信號增益為40倍，在沒有DIS的情況下只有極小的背景（圖4B）。通過使用不同濃度的DIS生成螢光校準曲線進一步測量了靈敏度（圖4C）。螢光信號增益隨DIS濃度的增加而增加（圖4D），線性範圍為0至10 μM，可檢測的極限500 nM（圖4E），在50％尿液樣本中獲得了相似的線性範圍和DIS的檢測限（圖4E）。
圖5. 反應25分鐘後，有無250 μM古柯鹼的COC-38和COC-38-M核酸外切酶消化產物的PAGE分析和雙核酸外切酶介導的螢光檢測古柯鹼的方法性能測定。（A）COC-38和（B）COC-38-M的寡核苷酸結構，以及通過Exo III，Exo I或兩者的混合物生成的消化產物的PAGE分析。突變的核苷酸標記為紅色。（C）在各種古柯鹼濃度下生成的樣品的螢光光譜。（D）從螢光光譜得出的校準曲線。（E）在緩衝液以及10％唾液中測定的線性範圍。
接下來，用古柯鹼適體(COC-38)證明了此方法的通用性，它是預摺疊的，並包含一個三向連接結構的結合域。類似於DIS-37，非靶標結合的COC-38被核酸外切酶混合物完全消化，但兩種酶都不能消化靶標結合的35 nt產物（圖5A，Exo M）。但是突變的適體由於其失去了與古柯鹼的結合親和力，在有無古柯鹼存在時都會被Exo M消化。用螢光法測定古柯鹼濃度時，獲得了0至10 μM的線性範圍，在緩衝液和10％唾液中的可檢測極限均為100 nM（圖5 E）。
圖6. 消化20分鐘後，有無250 μM ATP的情況下，ATP-33和ATP-33-M的核酸外切酶消化產物的PAGE分析，以及用於檢測核酸的雙核酸外切酶介導的螢光測定法。（A）ATP-33和（B）ATP-33-M的寡核苷酸結構，以及通過Exo III、Exo I或兩者的混合物生成的消化產物的PAGE分析。突變的核苷酸標記為紅色。（C）在各種ATP濃度下產生的樣品的螢光光譜。（D）從螢光光譜得出的校準曲線。（E）在緩衝液中測定的線性範圍。
接下來作者進一步證明了此方法可以用來檢測一般結構的ATP適體（ATP-33），其靶結合域的確切結構尚未最終確定。實驗結果表明此方法也能用於檢測ATP，檢出限為250 nM（圖6 C–E）。這些結果清楚地表明這種的核酸外切酶測定法廣泛適用於各種具有不同的二級結構的適體。
圖7. 雙核酸外切酶介導的基於適體的多重分子的檢測流程（A）僅古柯鹼，（B）僅ATP，（C）古柯鹼和ATP，（D）無靶標。在存在或不存在100 μM古柯鹼和/或ATP的情況下生成的FAM（綠色）和Cy5（紅色）的螢光光譜。
將雙核酸外切酶介導的檢測方法同時檢測多個小分子，為了進行多重分析，在有無古柯鹼和或ATP的情況下，將COC-38和ATP-33與Exo III和Exo I的混合物混勻，然後加入分子信標以實現目標檢測，實驗結果表明此方法可以同時檢測多個小分子。
圖8. 在有無古柯鹼和ATP的情況下，經核酸外切酶混合物處理的樣品的COC-MB（綠色，發射峰在520 nm）和ATP-MB（紅色，發射峰在668 nm）的螢光光譜。在兩個靶標的三個不同濃度下的螢光光譜結果表明，一個靶標的存在不會影響另一個靶標的螢光強度，因為在古柯鹼和ATP存在下產生的信號是相同的，而不管靶標是存在於混合物中還是單獨存在。兩者之間沒有串擾分子信標，因為每個螢光團都是在其各自的激發波長下單獨激發的。
總之，該團隊首次開發了一種簡單的雙核酸外切酶介導的測定方法。此測定法可快速，無標記，簡單而靈敏地檢測小分子分子目標，並能適用於具有各種二級結構，包括三向連接和髮夾結構地適體。重要的是，此方法還能檢測複雜生物樣品（如唾液和尿液）中的靶標，並能實現多種靶標的檢測。基於這些成功的結果，該檢測方法可用於多種應用，例如醫學診斷、藥物篩查、食品安全、環境監測和生物防禦。
https://pubs.acs.org/doi/10.1021/jacs.8b04975
作者簡介
Yi Xiao，佛羅裡達國際大學教授。
教育經歷：
1997年-2000年：南京大學 博士
2001年-2004年：耶路撒冷希伯來大學 博士後
2004年-2011年：加州大學聖塔芭芭拉拉分校 研究助理
2011年-至今：佛羅裡達國際大學
研究方向：1）基於納米材料的生物傳感器；2）基於DNA的生物傳感器；3）體外定向進化；4）利用生物技術與納米材料結合的新生物材料，以開發放大和一次性的生物傳感器，用於現場即時特定的體外或體內傳感。
付鳳富，福州大學化學學院教授，研究方向包括環境分析化學，食品安全分析，藥物分析，毒理分析。
教育工作經歷：
1983年9月-1987年7月：福州大學化學系，分析化學，學士
1987年7月-1993年10月：福州大學化學系，助教
1993年11月-1997年3月：日本東京農工大學，環境化學，碩士
1997年4月-2000年3月：日本東京農工大學，環境化學，博士
2000年4月-2002年3月：日本理化學研究所基礎研究部 契約研究員
2002年4月-2004年3月：日本原子能研究所環境科學部 研究員
2004年4月-2005年1月：山東大學環境科學與工程學院 教授
2005年2月-現在：福州大學化學化工學院/食品安全分析與檢測教育部重點實驗室，教授，博導
2005年11月-2007年2月：赴日本原子能研究所合作研究
2013年5月-2013年6月：赴美國弗羅裡達國際大學訪問
編輯：fffish
審核：長心的豐豐彐
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