背景
Toll樣受體（Toll-like Receptors, TLRs）是一類分子模式識別受體，先天性免疫系統的組成部分。他們識別出各種與感染相關的特定分子並啟動有效的免疫反應。TLR7和TLR8都位於內質膜，並能識別內體中富含胍/尿苷的單鏈RNA（ssRNA）。
TLRs的激活失調在多種自身免疫性疾病中發生，特別是系統性紅斑狼瘡（systemic lupus erythematosus，SLE）。因為機體自身的RNA可以通過與自身抗體的複合物進入核內體。
TLR7主要在血漿樹突細胞、B細胞中表達，而TLR8主要在單核細胞、巨噬細胞、嗜鹼性粒細胞中表達。而自身免疫性疾病涉及到體內多種免疫細胞。
過去，TLR7/8拮抗劑的發現和優化主要依賴於表型細胞實驗。
然而，TLR7和8的配體結合結構域(或胞外域，ECD)均位於核內體腔內，因此，表型細胞實驗僅僅有利於鑑定在核內體腔內局部富集的化合物。因此，一些核內體TLRs拮抗劑的作用模式被認為是依賴於核內體局部高濃度拮抗劑與TLR配體寡核苷酸的結合，而不是直接與受體相互作用。儘管這樣的化合物顯示出細胞功效，但這種作用方式所需的幾個基本基團會對理化性質、脫靶效應和藥物累計產生負面影響。因此研究者開發了一種可以檢測與TLR受體ECD直接相互作用的小分子的生化測試。由此發現並優化了系列高活性、高選擇性的TLR7/8小分子拮抗劑。
TLR8拮抗劑競爭性測試
為了設計能用於高通量篩選的測試系統，研究者利用螢光素標記的拮抗劑建立起了一個配體競爭性測試系統。基於他們之前發現的化合物1，研究者將螢光示蹤劑引入末端伯胺，得到探針分子2。
從苗頭到先導
研究人員從諾華分子庫大約50000個化合物中篩選出了苗頭化合物3，將化合物3與TLR8 ECD進行對接發現（TLR7和8顯示了高度的序列同源性，兩者可能在結構和功能上均緊密相關。因此，基於已報導的TLR8晶體結構，研究者對其進行同源重組並作為參考），兩個拮抗劑分子結合在兩個TLR8 ECDs界面的兩個對稱的口袋上，形成一個同型二聚體。吡啶酮的羰基與Gly351的NH形成氫鍵相互作用，哌嗪的NH+與Glu427形成一個鹽橋，喹唑啉母核位於結合口袋的疏水部分，與Phe495和Phe494形成面對邊相互作用。同時，對接結果顯示，Phe346、Tyr348、Val378形成的疏水口袋可以通過喹唑啉8位伸入。
在8位引入甲基，TLR8拮抗活性得到提高，然而TLR7的拮抗作用大大減弱，這一現象和原來的猜測（TLR7和8結構和功能類似）相駁，仔細對比TLR7和8序列發現，TLR7中有區別於TLR8的非保守胺基酸殘基（紫色字體）直接與配體形成相互作用。
基於以上分析，研究者將喹唑啉替換為吲唑，以此避免分子的雙環系統與胺基酸的空間碰撞，以及改變哌嗪的指向，避免其與Glu427（TLR8）的直接相互作用。
由於缺失了與TLR8中Glu427的直接相互作用，化合物5明顯降低了與TLR8的親和力，但也在一定程度上平衡了小分子對TLR7和8的效力。然而對TLR4和9的選擇性依然不足。
在吡啶酮環上不同位置引入甲基，其中化合物8顯示了較好的TLR7/8活性以及對TLR4/9的傑出選擇性。被選為進一步優化的先導化合物。
先導優化
TLR8受體結合效力及滲透性是優化的關鍵參數。
研究者從三個位置（R,R',R''）進行優化，首先是吡啶酮部分。對接顯示吡啶酮6位延伸方向僅僅狹小的空間可以進入。因此在6位引入一些小的取代基。此外，研究人員也將吡啶酮環化為5元並6元融合環，活性得到一定程度提高。
R'處的結構修飾顯示，該位置的取代對活性尤其重要，稍微大的取代基可以增強其活性。
對接顯示哌啶部分（R''）處於結合口袋的「出口」。因此該位置的修飾對活性影響不大，然而會通過鹼性的改變來影響細胞活性。基於該位置的SAR，研究者保留了4-哌啶取代以便進一步優化。
化合物11與TLR8 ECD共晶
化合物11與TLR8 ECD的共晶顯示，吡啶酮的羰基與Gly351的NH形成氫鍵相互作用，與Gln529*形成水分子介導的氫鍵，此外，吲唑N也與Tyr576*形成氫鍵。吲唑7位的甲基嵌入了胺基酸疏水口袋，而哌啶延伸至溶劑區，並未直接與Glu427發生相互作用。
組合優化
基於R,R',R''三部分獨立的SAR，研究者繼續探索組合兩部分最優取代的修飾。得到的化合物25細胞活性大大提高，然而滲透性有所減弱，可能是吡啶酮部分的環化增加了化合物的極性從而限制了滲透性。
因此研究者在哌啶上引入F，通過輕微降低pKa來改善滲透性，同時確保不會對細胞活性產生消極影響。得到的反式3-氟哌啶衍生物活性優於順式結構。其中又以化合物27在各種性質之間達到最佳平衡。
化合物27選擇性及PK
化合物27顯示了優良的選擇性、體外理化和ADME性質及較好的體內PK，包括適中的清除率，傑出的口服生物利用度等。
體內功效
化合物27能劑量依賴性抑制小鼠內IFNα的釋放，是一個有效的TLR通路抑制劑，有治療TLR7/8驅使的自身免疫性疾病的潛力。
總結
區別於傳統的基於細胞表型的測試，諾華的研究人員設計了一種配體競爭性測試方法，到目前為止，這是關於TLR配體結合測定法的首次報導，並且該測定法用作篩選工具能夠實現TLR8拮抗劑的快速優化。
該系列優化的關鍵在於： 1.由TLR7序列比對引導的母核替換實現了雙重TLR7/8拮抗作用；2.哌啶環上F的引入降低其鹼性，得到了更好的PK性質及TLR8親和力。
參考文獻
ThomasKnoepfel, et al. Target-Based Identification and Optimization of 5-Indazol-5-ylPyridones as Toll-like Receptor 7 and 8 Antagonists Using a Biochemical TLR8Antagonist Competition Assay. J. Med. Chem. 2020. DOI:10.1021/acs.jmedchem.0c00130.