Tittle：Major Impacts of Widespread Structural Variation onGene Expression and Crop Improvement
in Tomato
和其他廣泛種植的作物一樣，我們如今廣泛種植的番茄是從和其有親緣關係的野生物種中，經過馴化，人工選擇得來的，在這個過程中很多性狀都發生了變化，最明顯的就是果實的大小。在如今多種多樣的番茄品種當中也存在很大的表型的差異，但是導致這些表型差異的遺傳基礎很大一部分還並不清楚。
解決表型多樣性和遺傳基礎的問題，基本上等同於建立基因型和表型之間關係的問題，這也是遺傳學乃至整個生物學之中的核心問題。許多研究通過突變體的關聯分析、連鎖分析來試圖建立基因型和表型之間的關係。前提是我們需要測量存在的表型多樣性，以及在群體中測量的遺傳多樣性。
近年來高通量測序產生了大量的SNPs 和 small indels 的數據，這也是這些年用來主要建立遺傳多樣性和表型多樣性之間的主要數據，但是其中有一類變異類型被關注較少。
結構變異（Structural variants，SVs）指的是對於一個參考序列來說，比較大的缺失、插入或者是複製等。
也有許多單個結構變異在作物馴化改良中起作用的例子，在玉米tb1 中上遊有一個transpose插入導致基因表達變化，從而影響玉米的結構和形態；在番茄中，一個外顯子的插入導致番茄果實的沒有節花梗這個表型；番茄CLV3基因中一個片段的inversion導致其表達降低，果實大小受影響；番茄果實SlOFP基因啟動子區間的片段缺失影響果實的形狀。
檢測技術的進步：長測序
Fig1：The Tomato panSV Genome
Fig 2：SV Distribution Reveals Large-Scale Admixture and Introgression between Wild and Domesticated Genotypes
在早期馴化、野生和現代栽培品種番茄根據SNP建立的系統進化樹中，篩選了100個番茄品系，來代表番茄群體的遺傳多樣性
建立識別SV的工作流程：
在每個品系中SV的數量和類型：
在野生品種和早期馴化種中存在大量的SV
對100個SV進行聚類分析，發現其與SNP的聚類是近似的，表明Sv也能反映品系之間的親緣距離和關係
SVcollector curve ：隨著採用品系的數量增加，鑑定到的SV的變化趨勢。可以看到藍色的線條，即現代番茄品系，很快就趨於飽和，說明它的多樣性是較另外兩個品種而言更低的。而另外兩個增長更快，一方面說明由於測定品系的數量還有SV沒有被capture到，另一方面也表明他們的SV與參考基因組比起來具有很大的差異性。
SV content ：SV影響的序列具有什麼特性？其中最明顯的兩類是Copia和Gypsy
進一步分析這些SV在番茄的12條染色體上的分布特性，其中比較大段的SV分布暗示我們可能發生了基因漸滲
以4號染色體為例進行分析：在現代番茄中某些區段有較高的SV，而相對應的野生品種中的區段SV則較低。
對現代番茄品系和某一個有關的野生的品系進行比較，發現他們的相似性很高
Fig 3 ：SV Distribution Reveals Large-Scale Admixture
對SV進行注釋：SV主要落在基因的上下遊，這部分落在基因附近的SV很有可能會影響其功能
創新：利用3『 RNAseq 測了23個品系的三個組織，減少工作量
Fig4 ：SV對香氣的作用
番茄香氣揮發物質smoky 基因QTL定位到9號染色體，比對發現在其refreference genome 上遊有兩個gap
在更進一步對功能基因的研究中，表明nsgt1 基因影響番茄smoky 的風味，但是缺少在不同品系中同源基因的信息，對比參考基因組和gap區段，發現有部分的NSGT序列，表明有可能是gap miss了這些有序列，可以利用這些長read 序列重新組裝高質量的基因組
關聯分析表明 NSGT1的多態性 是解釋smoky 揮發物的原因
Fig 5 : SV 對果實大小的影響
fw3.2 果實重量的QTL，在SV數據中也發現了一個50kb相似的複製，找到了兩者的相關性
進一步利用cripr line 和 wt進行檢驗，鑑定F1,表明KLUH基因與果實重量的關聯
Fig6：對果實脫梗性狀的影響
生產上的形狀：果實脫梗
先利用SV組裝的高質量基因組找到二者關聯性，然後利用crispr進行驗證
通過純和的crispr 和雜合的crispr 突變與野生型的比較，說明這個duplication 就是引起果實脫梗的原因
這些sv 本身不影響花序的發育，但是在特定的遺傳背景下，會影響基因表達，進而影響生產上的一些重要性狀，例如脫梗表型
總結：
本文利用long-read 測序技術挖掘到了番茄基因組中豐富的結構變異信息，並利用經典的遺傳學手段將這些信息與基因功能進行關聯，利用基因編輯技術對表型進行驗證，從而為育種提供豐富的參考信息，結構完整，數據詳實，思路清晰
本文的數據分析工作量極大，對於生物信息的解讀和生物學意義的挖掘部分的寫作非常精彩，值得品讀借鑑
本文的數據呈現形式、圖表的表現形式直觀清晰明了，作圖方式值得參考學習
作為一篇cell級別的文章，本文完成了一項基於泛基因組信息的完整的研究該有的模樣，非常漂亮，且本文的第一作者應邀在嗶哩嗶哩上面發表了一個講座，輔助讀者進行文本的理解，更加容易上手。
長測序技術
1. 長序列測序和數據分析的現狀（The state of long-readsequencing and data analysis）
Nanopore和SMRT長序列測序技術依賴不同的原理。當單鏈核苷酸序列通過nanopore時，Nanopore測序儀（MinION、GridION和PromethION）測量的是離子電流波動，不同的核苷酸對孔內不同核酸延伸的抗性不同，因此可從特定的電流變換推斷鹼基序列。SMRT測序儀（RSII、Sequel和Sequel II）檢測的是特定核苷酸的螢光事件，SMRT測序的序列長度受聚合酶的壽命限制。儘管Nanopore和SMRT是真正的長序列測序技術，並且是本文的重點；但也有合成的長序列測序方法，包括連接序列、鄰位連接策略和光學測繪，可與真正長序列分析方法協同使用。
針對組裝基因組、甲基化、變異、異構體、單倍型以及物種分析等不同的分析目的，從2011年後逐漸開發了基於長序列數據分析的各種軟體（如圖1a）。
通過檢索文獻、網絡資源和社交媒體，我們找到了354種長序列分析工具，其中大多數（262）中為Nanopore序列分析工具，170個為SMRT分析工具。我們進一步根據功能將上述工具分為31個組。這確定了研究興趣發展的趨勢：由於長序列測序技術初始的通量問題，大多數工具都是經非人類數據進行測試；從頭組裝、錯誤校正和修飾分類的工具受到了最多關注，而轉錄組分析仍處於早期開發階段（如圖1b）。
如圖1c,我們對Nanopre和SMRT數據的分析流程進行了概述，重點介紹了通用工具；同時介紹了長序列分析的原理和潛在陷阱，集中於一些主要類型的下遊分析，如結構變異信息獲取，錯誤糾正，鹼基修飾的檢測和轉錄組。
圖1. 長序列分析工具和流程概述。a，已發布的工具；b，功能類別；c，用於SMRT和Nanopore數據的典型長序列分析流程。
Fig. 1 Overview of long-read analysis tools and pipelines. a，Release of tools identified from various sources and milestones of long-read sequencing. b,Functional categories. c, Typicallong-read analysis pipelines for SMRT and nanopore data. Six main stages are identified through the presented workflow (i.e. basecalling, quality control, read error correction, assembly/alignment, assembly refinement, and down stream analyses). The green-coloured boxes represent processes common to both short-read and long-read analyses. The orange-coloured boxes represent the processes unique to long-read analyses. Unfilled boxes represent optional steps. Commonly used tools for each step in long-read analysis are within brackets. Italicssignify tools developed by either PacBio or ONT companies, and non-italics signify tools developed by external parties. Arrows represent the direction of the workflow.
2. 鹼基判讀（Basecalling）
任何長序列分析的第一步都是鹼基判讀，或是將原始序列轉換到核酸序列。長序列分析中的此步驟比在短序列分析中更受到重視，而短序列分析中鹼基檢測依賴專門軟體，更標準化。Nanopore鹼基檢測比SMRT鹼基檢測更複雜，也更具有選擇性：我們發現26個鹼基判讀工具中有23個與Nanopore測序相關的。
在SMRT測序中，連續的螢光被記錄為一個movie。由於模版是環形的，聚合酶可能會多次越過DNA片段的兩條鏈。SMRT鹼基檢測從將螢光信號轉換為脈衝信號，再將脈衝信號轉換為鹼基開始，形成連續的長序列。然後將這種長序列拆分為多個子序列，其中每個子序列對應一次被測的文庫，而沒有連接序列。子序列存儲為未比對的BAM文件。將這些子序列比對，可以得出插入序列的一致性環狀序列（CCS）。SMRT鹼基判讀程序主要在於內部開發，並需要特殊訓練。當前SMRT的鹼基檢測流程就是CCS。
Nanopore原始數據是在HDF5的基礎上以fast5格式保存的4kHz下測量的電流強度值。Nanopore測序的鹼基檢測是一個活躍的研究領域，對其進行訓練的化學方法的算法正在迅速發展。ONT提供了鹼基判讀的多種軟體，如Guppy和其他進階版軟體（Flappie，Scrappie，Taiyaki，Runnie和Bonito）。總的來說，鹼基判讀軟體具有最佳準確性和最穩定的性能，並且適合大多數用戶。進階版的鹼基判讀軟體可以用來測試鹼基特徵，例如均聚物準確性、變異體檢測或鹼基修飾檢測，但不一定針對速度和整體準確性進行優化。
也可以使用具有不同網絡結構的獨立鹼基判讀軟體，最著名的是Chiron。當然，作為使用者，我們應該知道鹼基判讀軟體的準確度實際低於宣傳值。比如目前對ONT的鹼基檢測進行了人、酵母和細菌DNA混合物的訓練，但它們在富含非CG甲基化的植物DNA上的性能可能較低。
3. 錯誤、糾錯和拋光（Errors, correction, and polishing）
SMRT和Nanopore技術的單序列精度均比短序列測序更低。就SMRT而言，一致性環形序列的質量很大程度上取決於序列讀取的次數——單個SMRT-bell分子的測序深度。若錯誤不是隨機的，增加測序深度將不能消除它們。但是子序列由插入/缺失帶來的隨機錯誤比錯配更多，因此建議使用通用方法來避免系統誤差。儘管如此，CCS序列仍有錯誤並對均聚物表現出偏好性。就Nanopore而言，序列質量與DNA序列的長度無關。序列質量取決於實現核酸通過孔的最佳轉運速度，通常在測序運行的後期降低，從而影響測序質量。較為常見的是插入和替換，隨機但不均勻分布。
儘管目前長序列測序的準確性已足以確定基因組來源，但某些仍需要很高的鹼基水平的準確性，包括從頭組裝、變異檢測或定義內含子-外顯子邊界。可以採用單獨的長序列分析方法（非混合）和利用其他短序列的方法（混合）。如圖2所示。在非混合方法中，首先將所有序列比對，然後使用一致性序列來糾錯單個序列；此時就可以將這些糾錯過的片段用於組裝或其他應用。此外，還可以根據短序列的使用方法將混合糾錯方法進一步分類。
組裝完成後，從contigs中清除剩餘錯誤的過程稱為「拋光（polishing）」。其中一種方法是通過使用Arrow（用於SMRT子序列）或Nanopolish（用於Nanopore電流軌跡）來提高一致性序列的準確性。對於Nanopore數據，polishing還考慮了鹼基修飾來提高裝配的準確性。
儘管長序列測序的準確性不斷提高，但在許多應用中糾錯仍然是必不可少的。我們確定了62個能夠進行糾錯的工具。校正裝配需要綜合使用多種工具（如Racon、Pilon和Nanopolish）進行耐心細緻的工作。但由於缺乏權威的糾錯流程，使得很多糾錯工具無法很好地應用於深度測序或大型基因組中。此外大多數工具在設計時都考慮了單倍體組件，但等位基因變異、重複和基因家族可能無法正確處理。
圖2. 糾錯（a）和拋光（b）的範例。長序列和組裝中的錯誤用紅叉表示，非混合方法僅需長序列，混合方法還需準確的短序列（紫色）。
Fig. 2 Paradigms of error correction(a) and polishing (b). Errors in long reads and assembly are denoted by red crosses. Non-hybrid methods only require long reads, while hybrid methods additionally require accurate short reads (purple).
4.檢測結構變異
儘管短序列能夠準確檢測單核苷酸變異和小片段插入或刪除，但不適用於檢測長序列改變。大於50bp的結構變異（SV），如插入、刪除、重複、染色體倒位或易位更適合用長序列測序。長序列測序跨越重複元件或重複區域的能力具有獨特的錨點，從而有利於從頭組裝和SV檢測。即使是相對較短的SMRT片段（5kb），也可以鑑定出人類基因組中先前被短序列技術遺漏的結構變異。
5. 檢測鹼基修飾
除了規範的A、T、C和G鹼基外，DNA還包括修飾鹼基，這些鹼基的性質和頻率在生物體和組織間會發生改變，6mA、4mC、5mC在細菌中很常見，5mC是真核生物中最常見的鹼基修飾，而5hmC、5fC和5caC已經在某些哺乳動物細胞中檢測到，但尚未得到深入表徵；此外由DNA損傷引起的更多鹼基修飾仍在低頻發生。SMRT測序可以檢測到6mA、4mC、5mC和5hmC的DNA修飾。Nanopore測序中，經修飾的RNA或DNA鹼基對電流通過孔的影響與未修飾鹼基的影響不同，從而導致信號移位（如表1）。如圖3，可以通過三種不同的方法在鹼基判讀後和比對後識別這些變化：（a）通過與計算機參考庫、對照或未修飾樣本比對；（b）使用預訓練模型；（c）直接使用鹼基判讀軟體。
表1 檢測Nanopore數據鹼基修飾的工具和測量
圖3 長序列測序中檢測鹼基修飾的方法。
Fig.3 Methods to detect base modifications in long-read sequencing. Base modifications can be inferred from their effect on the current intensity (nanopore)and inter-pulse duration (IPD, SMRT). Strategies to call base modifications in nanopore sequencing and the corresponding tools are further depicted.
6. 分析長序列轉錄組（Analysing long-read transcriptomes）
可變剪切是增加真核生物基因表達複雜度的主要機制，然而短序列不能完全組裝也不能準確定量所表達的異構體，尤其是在複雜的位點中。長序列測序可能會通過測序全長轉錄本來解決這個問題，我們統計了36種與長序列轉錄組分析相關的工具。大多數長序列異構體檢測工具是通過將比對和糾錯的序列聚類並拼接為異構體，但是不同工具之間的具體實現有所不同。PacBio公司的ISO-SEQ3是最成熟的長序列轉錄組分析流程，能夠裝配全長的轉錄本；它為SMRT序列執行預處理，通過層次聚類和迭代合併從頭發現轉錄本，並進行修飾。Cupcake用於下遊分析，提供了豐度信息並進行junction分析。但是Iso-Seq的文庫準備通常需要大小分級，這使得絕對定量和相對定量變得困難；同時昂貴的成本也是需要考慮的問題之一。因此，IsoCon、SQANTI、TALON等異構體檢測流程，以及FLAIR、Tama、IDP、TAPIS、Mandalorion Episode II等異構體注釋流程應運而生，從不同方面改善了Iso-Seq的上述問題。但此項功能仍需要進一步的研發和調整。如圖4，展示了轉錄組分析的類型及步驟。
圖4 轉錄組分析的類型及步驟
Fig.4 Types of transcriptomic analyses and their steps.The choice of sequencing protocol amongst the six available workflows affects the type, characteristics, and quantity of data generated. Only direct RNA sequencing allows epitranscriptomic studies, but SMRT direct RNA sequencing is a custom technique that is not fully supported. The remaining non-exclusive applications are isoform detection, quantification, and differential analysis. The dashed lines in arrows represent upstream processes to transcriptomics
7. 組合長序列、合成長序列和短序列（Combining long reads, synthetic long reads, and short reads）
僅基於長序列的組裝通常會產生高度完整和連續的基因組，但是多數情況下，短序列或合成長序列技術產生的序列可進一步改善結果。不同的技術可以以不同的規模進行幹預：短序列可確保基本水平的準確性，高質量5-15kb SMRT序列可產生良好的contigs，而超長（100kb+）Nanopore序列、光學映射或Hi-C提升了contigs拼裝後轉變為染色體的能力。將這些技術應用到一個基因組計劃中將是非常昂貴的。然而，應用在一些基因子集中是比較常見的，尤其Nanopore/SMRT的短序列測序。
對於結構變化或鹼基修飾的檢測，從SMRT和Nanopore數據獲取的正交支持可用於確認發現和限制假陽性。諸如Unicycler之類的工具整合了長序列和短序列數據以生成混合組裝，而Canu、Pilon、racon等工具也具有為實現此目的的流程。然而工具和數據類型的組成仍然是一個挑戰，通常需要大量的人工整合。
8. 長序列測序數據分析工具目錄：long-read-tools.org （long-read-tools.org: acatalogue of long-read sequencing data analysis tools）
在過去十年中，工具的迅猛發展反映了生物學領域對長序列測序日益增長的興趣。有開源靜態目錄（github.com/B-UMMI/long-read-catalog）、各個實驗室為特定目的開發的自定義流程（Search results from GitHub）以及其他將其歸納為一個更廣泛的研究社區的嘗試。能夠輕鬆識別存在或不存在的工具對於計劃和執行最佳實踐分析，建立全面的基準並指導新軟體的開發至關重要。因此我們引入了https://long-read-tools.org/，這是一個整合了長序列數據分析工具的實時資料庫。用戶可以按照技術和預期分析類型交互式搜索相應工具。除了真正的長序列測序技術之外，我們還整合了合成長序列方法。https://long-read-tools.org/是MIT許可下的一個開源項目，代碼可通過GitHub獲得。我們鼓勵研究人員直接通過GitHub或通過網頁為相關工具和資料庫的改進提供意見
第四代基因測序技術Oxford Nanopore納米孔測序技術（又稱第四代測序技術）是最近幾年興起的新一代測序技術。目前測序長度可以達到150kb。這項技術開始於90年代，經歷了三個主要的技術革新：一、單分子DNA從納米孔通過；二、納米孔上的酶對於測序分子在單核苷酸精度的控制；三、單核苷酸的測序精度控制。目前市場上廣泛接受的納米孔測序平臺是Oxford Nanopore Technologies（ONT）公司的MinION納米孔測序儀。它的特點是單分子測序，測序讀長長（超過150kb），測序速度快，測序數據實時監控，機器方便攜帶等。這篇綜述重點總結了MinION測序儀的技術特點和應用領域。
一、 MinION測序技術簡介
MinION納米孔測序儀的核心是一個有2,048個納米孔，分成512組，由專用集成電路控制的flow cell。測序原理見圖1a所示：首先，將雙分子DNA連接lead adaptor（藍色），hairpin adaptor（紅色）和trailing adaptor（棕色）；當測序開始，lead adaptor帶領測序分子進入由酶控制的納米孔，lead adaptor後是template read（即待測序的DNA分子）通過納米孔，hairpin adaptor的作用是DNA雙鏈測序的保證，然後complement read（待測序分子的互補鏈）通過納米孔，最後是trailing adaptor通過。在上述測序方法中，template read和complement read依次通過納米孔，利用pairwise alignment，它們組合成2D read；而在另外一種測序方法中，不使用hairpin adaptor，只測序template read，最終形成1D read。後一種測序方法通量更高，但是測序準確性低於2D read。每個接頭序列（adaptor）通過納米孔引起的電流變化不同（圖1c），這種差別可以用來做鹼基識別。
二、 MinION相對於其他NGS測序平臺的優勢
1、鹼基修飾的檢測
納米孔測序技術可以檢測四種胞嘧啶（cytosine）鹼基修飾，分別為5－methycytosine，5－hydroxymethycytosine，5－formylcytosine和5－carboxylcytosine。檢測準確率為92％－98％。
2、實時測序監控
對於臨床實踐，實時獲取和分析DNA／RNA序列是一件很重要的事情。對於傳統的NGS測序，做到這一點非常不易。但對於MinION，實現起來相對容易。這不僅是因為MinION體積小，易操作等，更是因為在測序過程中單分子穿過納米孔，其電流變化可以檢測並識別，這種設計允許用戶在測序過程中根據實時結果做出一些判斷。
實時測序監控對於MinION針對特定目標序列測序有重要的應用（圖2）：當DNA片段通過納米孔時，如果電流變化呈現與目標序列一樣的趨勢，則通過納米孔。如果DNA片段與目標序列呈現不同的電流變化趨勢，則不能通過納米孔。通過這樣的方式，實現目標序列的富集，從而顯著減少測序時間，對於在野外和即時診療有重要意義。
3、測得更長的read
用MinION測序儀，對於1D read可以獲得300kb長的read；對於2D read可以獲得60kb長的read。利用MinION測序儀產生的長read，研究人員設法填充了人參考基因組Xq24號染色體一個長50kb的gap。該區域存在多個CT47基因串聯拷貝，研究人員利用MinION的長read判斷該區域極有可能存在8個CT47基因拷貝（圖3）。
4、結構變異的檢測
NGS短序列的特徵使結構變異的檢測往往不準確。這個問題在癌症的檢測中尤其嚴重，這是因為癌症組織中充斥各種結構變異。研究人員發現利用MinION測得的幾百個拷貝的長read得到的結構變異結果比NGS平臺測得的上百萬read得到的結果更可靠。
5、RNA表達分析
對於RNA表達分析，NGS平臺測得的短序列帶來的問題是序列需要進行拼接，才能得到轉錄本。這給可變剪切研究帶來困擾。因為通常情況下NGS測序不能產生足夠的信息將不同形式的可變剪切區分開來。而利用MinION測序儀產生的長read，可以更好地解決這個問題。研究人員利用果蠅的Dscam1基因為例，其存在18，612種可變剪切形式，利用MinION測序儀可以檢測到超過7，000種可變剪切形式，而這樣的結果利用NGS的短序列測序是不能夠獲得的。
三、生物信息學配套軟體的發展
近些年來，隨著生物信息分析方法的發展，MinION測序reads成功比對參考基因組的比例已經從66％提升至92％。文章下面對各種工具的適用場景進行了分別介紹。工具概述見表1。
1、鹼基識別工具
Metrichor是ONT公司推出的基於隱馬爾可夫模型進行鹼基識別的軟體。它的使用需要網絡連接。MinION註冊用戶需要獲得開發者帳號才能獲得軟體的原始碼。2016年初，兩個實驗室分別開發了Nanocall和DeepNano軟體。這兩個軟體都可以在本地運行，不需要網絡連接。Nanocall基於隱馬爾可夫模型，可對1D read在本地進行鹼基識別；DeepNano基於recurrent neural network framework，可以獲得比隱馬爾可夫模型更準確的鹼基識別。
2、序列比對工具
傳統的NGS序列比對軟體不能滿足MinION序列比對的需求。這是因為MinION測序數據錯誤率相對高且序列長，即使調整參數也不能取得好的效果。在這種情況下，適合MinION測序數據的比對軟體應運而生。
MarginAlign是通過更好地估計MinION測序reads測序錯誤來源從而提高與參考基因組的比對效率。通過評估檢測到的變異，發現其顯著提高了比對的準確性。由於MarginAlign是基於LAST或BWA mem的比對結果進行優化，結果的最終準確性依賴最初的比對結果。
GraphMap是另一個用於MinION測序數據比對的軟體。它利用的是一種啟發式（heuristics）方法，對高錯誤率reads和長reads進行了優化。一項研究表明GraphMap比對的靈敏性可與BLAST媲美，且它對reads測序錯誤率的估計與MarginAlign相當。
3、從頭組裝工具
MinION測序數據不適合利用NGS數據組裝的de Bruijn圖法進行組裝，主要存在兩方面的原因。第一，de Bruijn圖法等方法依賴測序reads拆分的k－mer測序準確，而高錯誤率的MinION測序reads不能保證這一點；第二，de Bruijn圖的結構不適用長reads。
MinION測序數據的長reads更適合Sanger測序時期基於有overlap的共有（consensus）序列組裝的方法。需要的是在組裝前進行測序reads的糾錯。第一個基於這種原理進行組裝的研究組利用MinION數據組裝了一個完整的E． coli K－12 MG1655基因組，序列準確率達到99．5％。他們利用的流程稱為nanocorrect，首先利用graph－ based，greedy partial order aligner方法進行糾錯，然後利用Celera Assembler將糾錯後的reads進行組裝，最後利用nanopolish對組裝結果進行進一步提升。
4、單核苷酸變異檢測工具
Reference allele bias是一種在變異檢測中傾向於少檢測出變異的現象。該現象在測序reads錯誤率高的情況下尤為嚴重。
MarginAlign中的marginCaller模塊是研究機構開發的適用於MinION測序數據的變異檢測軟體。MarginCaller利用maximum－likelihood參數估計和多條測序reads序列比對來檢測單核苷酸變異。當計算機模擬出測序錯誤為1％時，測序深度在60X，marginCaller檢測出的SNV具有97％的準確率和完整度。另外一項研究中，研究者利用GraphMap方法，檢測人基因組的雜合變異，可以達到96％的準確率。利用計算機模擬的數據，GraphMap同樣可以高準確率，高完整度地檢測出結構變異。
Nanopolish也可以用來檢測變異。它用的是event－level alignment算法。在該方法中，從參考基因組序列開始，依次評估參考基因組序列產生的電信號與測序reads的相似性進而依次修飾參考基因組序列，生成一個consensus read。直到consensus read與測序read產生的電信號足夠相似，將consensus read與參考基因組序列比較，得到變異。該方法在伊波拉病毒的研究中有大約80％的準確性。
PoreSeq採用與Nanopolish類似的算法。它可以利用更低深度的測序數據獲得高準確率和高完整度的SNV檢測。在一項研究中，PoreSeq在16X測序深度下獲得99％準確率和完整度的SNV檢測，與marginAlign相比，它顯著降低了測序深度。
5、共有序列的測序（consensus sequencing）方法
MinION測序數據目前只有92％的準確性。在低深度測序的情況下，不能夠滿足類似單體型（haplotype phasing）和人樣品的SNV檢測的要求。文章提到的解決問題的方法是rolling circle amplication，它的原理是將一個片段進行多次擴增，在一個DNA分子上生成多個拷貝，這樣最終獲得的共有序列測序結果的準確率可以達到97％。
四、MinION目前的應用領域
1、即時檢測傳染源
NGS測序方法可以在醫院環境下進行傳染源等病菌的檢測，而MinION測序方法提供的是一種全新的體驗。MinION在測序讀長，攜帶的方便性，檢測時長方面具有NGS不可比的優勢。文獻記載從樣品準備到發現致病菌只需要6小時時間，而從樣品放置機器到發現致病菌只需要4分鐘。文章列舉了截至目前用MinION測序儀涉及研究的物種及詳細描述了西非爆發伊波拉病毒時，MinION測序方法在病毒檢測過程中起到的重要作用。
2、非整倍體檢測
MinION可以在胎兒非整倍體產前檢測中發揮重要作用。利用NGS平臺，通常需要1－3周時間獲得結果。而利用MinION測序方法，文獻報導只需要4小時。
3、太空應用
在太空飛行中，發掘細菌和病毒是很困難的事情。大部分研究是將樣品帶回地球進行測序鑑定。目前，NASA準備利用MinION測序儀在國際空間站進行病菌的實時測序。
五、 展望
1、PromethION
為了滿足研究人員對高通量測序的需求，ONT公司開發了一個臺式納米孔測序儀—PromethION。PromethION有48個flow cell，可以單獨運行也可以並行。每個flow cell包括3，000個通道（channel），每天產生6Tb測序數據。
2、測序read準確性
目前MinION測序儀的測序準確率在92％左右。對於類似致病菌和可變剪切的發掘，這樣的測序準確率可以滿足需求。但是對於臨床檢測，通常read準確率需要達到99．99％。因此，文章提到ONT公司需要在測序相關的化學反應和鹼基識別軟體方面進行優化。
另外，文章提到MinION測序方法存在非隨機的測序錯誤。比如MinION不能很好處理長於6個核苷酸的同聚物的測序，同時缺少鹼基修飾檢測的內參訓練。如果這兩個問題能夠得到解決，共有序列（consensus）測序的準確率可以達到大於99．99％。
3、測序read長度
目前MinION測序長度達到150kb。在未來一段時間，可以期許其測序長度可以得到更大提升。
4、RNA直接測序
逆轉錄和PCR擴增會導致很多RNA自身信息的丟失，所以目前ONT公司和一些研究機構正在嘗試用納米孔技術進行RNA直接測序。之前的研究已經為此奠定了基礎，比如研究表明可以對tRNA進行單通道和固態納米孔（solid－state nanopore）檢測，且納米孔可以檢測DNA和tRNA的鹼基修飾。
5、單分子蛋白測序
目前，質譜（mass spectrometry）是做蛋白組分析較好的技術，但是對於靈敏性，準確性和解析度，目前的技術都存在局限性。2013年一項研究報導了酶介導的蛋白通過單通道納米孔。這項研究表明蛋白的序列特徵可以被檢測。這些發現為蛋白質納米孔測序奠定了很好的基礎
番茄果實成熟及有關突變體研究進展
番茄（Lycopersicon esculentum）果實色澤鮮豔，口感酸甜，含有豐富的番茄紅素、葉黃素、β-胡蘿蔔素等。番茄做菜不但味美營養、健體抗癌，還能幫助消化，是一種廣泛種植、經濟價值高的大宗蔬菜。番茄也是果實發育研究的經典模式體系：生長周期短，植株產量高，基因組較小（約950Mb），遺傳轉化體系成熟[1]，具有眾多公開資料庫。因此，番茄是果實成熟與品質研究的絕佳生物底盤。
果實成熟是由複雜的內源和外源信號介導，由一系列相互作用的基因和信號網絡緊密協調的從營養生長轉向生殖生長轉變的發育過程。在成熟過程中果實發生一系列的生理生化變化，進而影響果實的外觀、質地、風味和香氣[2]，了解調控果實成熟的遺傳和分子基礎是提高果實整體品質的核心任務之一。
突變體是研究基因功能及番茄果實成熟機制的重要的生物材料，番茄成熟突變體果實的成熟調控體系存在缺陷，突變體果實顏色和乙烯呼吸峰會發生顯著的變化。對不同突變體的深入研究揭示了番茄果實成熟所涉及的途徑和影響因子，完善了番茄果實成熟的機制[3]。綜述番茄果實成熟突變體的研究進展，對進一步了解果實成熟機制與番茄果實品質形成機理有重要作用。
1番茄果實成熟調控
番茄是一種嚴格的呼吸躍變型果實，其成熟嚴格依賴於乙烯的合成及信號轉導[4]。在番茄果實中存在兩套乙烯系統（如圖1），果實生長進入綠熟期以後果實產生大量的乙烯，產生的乙烯通過誘導ACS2、4、1A和ACO1、4等基因的表達進一步促進果實內源乙烯的生物合成，完成乙烯的自我催化，從而大大加快果實成熟的進程。但在營養生長階段和未進入綠熟期時，乙烯則通過抑制ACS6和ACO1、4基因的表達來抑制自身的產生。
圖1：番茄果實成熟過程中呼吸峰和乙烯峰變化[4]
在從野生番茄到栽培番茄的馴化過程中，番茄基因組發生過三次大規模多倍化事件[1]，經歷了基因家族擴張和功能轉變，在此過程中發現了許多乙烯相關的突變體，對這些突變體的深入研究和定位發現在乙烯信號通路的不同環節控制果實的成熟[5]。例如Never ripe（Nr）、Green ripe（Gr） 和 yellow‑fruited tomato 1（yft1）均是由於乙烯信號傳導受阻而無法正常成熟，而ripening inhibitor（rin）、non-ripening（nor）和 Colorless non-ripening（Cnr）等突變體則是作用於乙烯的上遊，通過依賴和不依賴乙烯的信號途徑調控果實成熟[6]。圖位克隆分析顯示 RIN 編碼一個MADS-box轉錄因子，Nor編碼一個NAC轉錄因子，而Cnr 則是一個表觀遺傳突變，該突變是由於一個SBP類型的轉錄因子基因啟動子區域 DNA甲基化升高導致的。乙烯及有關轉錄因子調控果實成熟的模式如圖2所示[7]，其中編號1-7是通過實驗驗證能有效控制乙烯合成的步驟。
圖2：乙烯和轉錄調控因子控制番茄果實成熟[7]
2.乙烯相關突變體研究進展
2.1 ripening inhibitor（rin）
目前研究最多的當屬由康奈爾大學的Munger首先發現的rin突變體，對其的研究已經跨越了半個多世紀。rin果實成熟時為綠色，隨後轉變為亮黃色，延遲成熟，完全抑制與成熟相關的生理特徵的改變，包括紅色素沉澱、變軟、揮發物質的產生及呼吸躍變時乙烯水平的增加，外源乙烯處理也不能恢復成熟。2012年在science上報導rin 是隱性突變體[8]，野生型番茄果實中，RIN基因編碼MADS-RIN轉錄因子，調控數百個成熟相關基因的表達，是果實成熟的關鍵調控因子；MC基因編碼MADS-MC轉錄因子，在果實成熟過程中的作用忽略不計。在2017年，在Plant Physiology上發文表明rin的表型源於DNA片段的部分缺失[9]，導致相鄰編碼兩個重要轉錄因子基因RIN和MC部分缺失後發生了融合，融合後的RIN-MC為一個新的轉錄因子調控番茄果實的成熟。另外，在番茄裡，MADS轉錄因子RIN和TAGL1可以直接結合在乙烯合成基因ACS2和ACO1的啟動子區，激活它們的表達，並產生乙烯，而乙烯又可以反過來穩定乙烯信號傳導轉錄因子EIN3蛋白，EIN3蛋白重新耦合到MADS-RIN基因的啟動子區，形成一個正反饋環(positive feedback loop)，如圖3所示。這個環造成了呼吸躍變果實中的自催化乙烯合成，而且直接調控果實成熟相關的下遊基因，如使果實變軟，顏色發生變化等基因。
圖3：果實成熟的轉錄反饋迴路[15]
2.2 nor (non-ripening)
nor(non-ripening)是Tigchelaar在l973首先發現的自發突變體，nor果實轉色極其緩慢，不軟化，有較高的抗擠壓能力[10]。nor基因編碼NAC轉錄因子，NAC 家族轉錄因子 NOR基因第三個外顯子區域缺失2個連續的鹼基A而導致移碼突變，NOR蛋白質翻譯提前終止，生成包含186個胺基酸的截短蛋白，起初認為是該基因的功能突變導致了果實的不成熟表型，2017年研究發現nor自然突變體中殘存的包含186 個胺基酸的截短蛋白[11]，NOR186仍然可以進入細胞核，能夠結合但不能激活乙烯生物合成、類胡蘿蔔素積累以及果實軟化關鍵基因SlACS2 、SlGgpps2 、SlPL的啟動子。並且野生型NOR 蛋白對上述啟動子的激活效應會被NOR186 所抑制。上述研究結果表明nor自然突變體是功能獲得性突變體，其中NOR基因突變產生的截短蛋白質NOR186 具有顯性負性功能，同時NAC家族轉錄因子NOR-like1是番茄果實成熟的正調控因子，NOR-like1調控乙烯合成、葉綠素降解、類胡蘿蔔素積累以及果實軟化途徑中的重要靶基因。同時還發現NAC-NOR轉錄因子存在翻譯後修飾[12]，NOR是番茄中甲硫氨酸亞碸還原酶A和B（分別為E4和SlMsrB2）的靶標，NOR中的蛋氨酸氧化（即硫氧化或通過將Met138突變為穀氨醯胺來模仿硫氧化）會降低其DNA結合能力和體外轉錄調控活性。
2.3 Colourless non-ripening（Cnr）
Cnr是1999被Andrew發現的多向性的成熟突變體，它是從一個商品品種Lycopersicon esculentum cv. Liberto的F1中自發突變產生的，其純合體是通過四代自交獲得。果實質地堅硬，成熟果實顏色變為黃色，果皮色素量很低，內果皮組織仍然沒有色素即仍保持白色, 沒有呼吸躍變，對外源乙烯也不能響應[14]。與rin突變體不同的是，Cnr 突變體不是由於LeSPL-CNR的缺失引起的[13]，而是由於LeSPL-CNR的啟動子發生了變異,是 DNA的甲基化所引起的。在Cnr突變體中，LeSPL-CNR的上遊有 286bp 連續的高甲基化區域，利用病毒誘導基因沉默的方法將LeSPL-CNR沉默，番茄果實最終會變成黃色，而不會變成紅色，即抑制了番茄果實的成熟，表明LeSPL-CNR在控制番茄果實成熟過程中起著關鍵作用。香港中文大學鍾思林課題組發現番茄果實裡出現了全基因組DNA去甲基化，DNA甲基化是除了轉錄因子和乙烯之外控制番茄成熟的重要因子[15]。
2.4 Never ripe(Nr)
Never ripe(Nr)是由Rick於1956年首先發現的自發突變體，成熟緩慢、最終為橙黃色。Never-ripe 2( Nr-2) 突變體是Kerr於1982年在育種過程中分離出的一種自發突變體[16],同樣成熟緩慢，果實最終呈黃綠色，硬度較大。與rin、nr、cnr這三個通過作用於乙烯上遊調控果實成熟的突變體不同，Nr、Nr-2突變體是由於乙烯信號轉導受阻而使果實無法正常成熟。NR編碼乙烯受體之一 LeETR3。Nr-2與Gr同源，這對等位基因位於1號染色體的長臂重疊區域。
2.5 Green-ripe(Gr)
Green-ripe(Gr) 突變體由kerr 1958首先發現，果實為綠色，除了果實中部轉紅外，其它部位成熟時仍為綠色。Gr 突變體是由於跨 Gr 基因的啟動子區域和 5'端非翻譯區域的 334個核苷酸的缺失導致 Gr 基因的異常表達，從而影響了果實的發育和成熟[17]。Gr編碼擬南芥RTE1的同源蛋白，RTE1蛋白被報導可與乙烯受體AtETR1 互作並修飾 AtETR1的活性[18]。番茄和過表達組合rte1-3突變體等位基因的互補性實驗表明SlGR和SlGRL1影響不同，但重疊響應乙烯信號，AtRTE1在番茄中的過表達降低了一部分組織的乙烯響應敏感度，但不回復Gr突變表型，表明GR/RTE1家族成員調控乙烯反應的具有物種特異性。
3類胡蘿蔔素代謝通路中果實顏色天然突變體
番茄中已克隆多個果肉顏色發生變化的突變體，如表1所示，其中大部分是由於類胡蘿蔔素合成途徑的酶突變引起的，如圖4所示[19]。yellow flesh 為黃色果肉，由八氫番茄紅素合成酶基因PSY1突變導致。目前在番茄中分離鑑定出2個八氫番茄紅素合酶基因PSY1和PSY2，其中PSY1在果實和花中特異表達，而PSY2在葉片中表達[30]。Fraser 等在2002在番茄中過表達PSY基因，果實中類胡蘿蔔素總量增加2 ~ 4倍，而番茄紅素、β–胡蘿蔔素和葉黃素分別增加了2.4倍、1.8倍和2.2倍。Fray 和 Grierson在1993首次鑑定出番茄 r 突變體（yellow-flesh）是由於PSY1基因發生突變，導致成熟果實呈現黃色。而 Fantini 等在2013、Ambrosio 等在2018分別運用基因沉默和 CRISPR/Cas9 技術，發現PSY1基因功能缺失，致使番茄果實變為黃色，再次證實PSY1基因的功能。tangerine和fruit carotenoid-deficient為橘黃色果肉，分別由類胡蘿蔔素異構酶基因CRTISO和異戊烯基焦磷酸異構酶基因IDI1突變導致。類胡蘿蔔素異構酶基因CRTISO突變，果實呈現橘黃色，該突變體的四順式番茄紅素下遊的類胡蘿蔔素組分顯著減少。兩個來源於野生番茄的顯性突變位點Beta 和Delta也可使果肉呈橘黃色，其中Beta編碼番茄紅素β–環化酶，而Delta編碼番茄紅素ε–環化酶，Beta 和 old gold 互為等位基因，Beta突變體為功能獲得性突變，LYC-B基因轉錄水平升高，果實中的β–胡蘿蔔素積累；old gold突變體為移碼突變，導致缺少LYC-B，無法合成β–胡蘿蔔素而使果實中全反式番茄紅素積累較多，果實呈深紅色。
圖4：類胡蘿蔔素代謝與果實顏色突變體[19]
質體（包括葉綠體和有色體）是合成葉綠素和類胡蘿蔔素的主要場所，果實中質體大小和數量 的變化也影響番茄果實的顏色。番茄高色素突變體 high pigment 1（hp1）、high pigment 2（hp2）和 high pigment 3（hp3）中類胡蘿蔔素含量的增加都歸功於質體數的增多和體積增大。HP1 和 HP2 分別編碼光信號負調控因子（UV-damaged DNA-binding protein 1，DDB1）和 DE-ETIOLATED1（DET1），而HP3編碼玉米黃質環氧化酶（Zeaxanthin epoxidase，ZEP）。克隆 hp1和 hp2 突變體與表型有關的基因，發現果實中的類胡蘿蔔素和黃酮類化合物的含量都有升高。
表1番茄果實顏色天然突變體
突變體
表型
類胡蘿蔔素積累
基因
描述
參考文獻
fcd1
(fruit carotenoid deficient 1)
Pale orange fruit
Little carotenoid accumulation
IDI1
Loss of or decreased enzyme activity; due to either a nonsense mutation (fcd1-2, fcd1at), a deletion (fcd1-1) or a missense mutation (fcd1-3
Pankratov et al., 2016[20]
og (old-gold),
ogc (oldgold crimson)
Deep red fruit
lacking b-carotene and increased lycopene accumulation
CYCB
Loss of enzyme activity; caused by a single base insertion
Ronen et al., 2000[21]
r (yellow flesh), r
Yellow fruit
lacking carotenoids (yellow pigments are flavonoids
PSY1
Loss of enzyme activity; due to a deletion (r y ) or mutation(s)
Fray and Grierson, 1993[22]
tangerinemic
Orange fruit
accumulation of prolycopene instead
CRTISO
Loss of enzyme activity; due to a deletion
Isaacson et al., 2002[23]
wf1
(white flower 1)
White flowe
lacking carotenoids
CrtR-b2 (flowerspecific BCH
Loss of enzyme activity; due to a
deletion (wf1-1, wf1-3) or a
single base substitution (wf1-2)
Galpaz et al., 2006[24]
B (Beta)
Orange fruit
increased accumulation of b-Carotene and decreased accumulation of lycopene
CYCB
Enhanced expression; due to
six insertions and a
deletion in the promoter
Ronen et al., 2000[25]
nxd1 (neoxanthindeficient 1)
Pale yellow flower
lacking neoxanthin
Nxd1 (NSY)
Decreased expression; due to a deletion (nxd1-1) or a single base substitution (nxd1-2)
Neuman et al., 2014[26]
tangerine3183
Orange fruit
accumulation of prolycopene instead of lycopene
CRTISO
No expression; due to a deletion in the promoter
Isaacson et al., 2002[23]
hp-1
(high pigment-1)
Darker green leaves and deeper red fruit
increased accumulation of carotenoids in all tissues; increased plastid
HP-1 (DDB1, UVDAMAGED DNABINDING PROTEIN 1)
A single base substitution in coding sequence
Cookson et al., 2003[27]
hp-2
Darker green leaves and deeper red fruit
increased
plastid number and
compartment size
HP-2 (DET1, DEETIOLATED1)
A single base substitution in coding sequence
Mustilli et al., 1999[28]
hp-3
Darker green leaves and deeper red fruit
increased plastid number and compartment size
ZEP
A single base substitute on in coding sequence
Galpaz et al., 2008[29]
4.展望
果實的成熟機制是一個非常複雜的調控網絡，因此闡明番茄果實的成熟調控網絡，不僅對番茄的成熟機制研究和品種改良具有十分重要的意義，而且對其他肉質果實成熟機制的研究也具有非常重要的意義。對於已經發現的果實成熟突變體，研究的比較深入的有 rin、Cnr、nor等，但是也有很多突變體並沒有得到廣泛的研究，與其他轉錄因子的關係也不是很清楚。所以未來的研究一方面要繼續發現新的果實成熟突變體; 另一方面要系統地研究番茄果實成熟相關轉錄因子之間的關係以及協同調控果實成熟的機制，更加完善番茄果實成熟的調控網絡。
參考文獻：
[1]. Klee HarryJ.,Giovannoni James J.. Genetics and Control of Tomato Fruit Ripening andQuality Attributes[J]. Annual Review of Genetics,2011,45.
[2]. RufangWang,Gerco C. Angenent,Graham Seymour,Ruud A. de Maagd. Revisiting the Role ofMaster Regulators in Tomato Ripening[J]. Trends in Plant Science,2020,25(3).
[3]. YutingLuan,Xiumin Fu,Pengjun Lu,Donald Grierson,Changjie Xu. Molecular MechanismsDetermining the Differential Accumulation of Carotenoids in Plant Species andVarieties[J]. Critical Reviews in Plant Sciences,2020,39(2).
[4].Liu M , Pirrello J , Chervin C , et al. EthyleneControl of Fruit Ripening: Revisiting the Complex Network of TranscriptionalRegulation[J]. Plant Physiology, 2015, 169(4).
[5]. Rumyana K, Natalie C , Karine D , et al. Transcriptional control of fleshy fruitdevelopment and ripening[J]. Journal of Experimental Botany(16):4527-4541.
[6]. 杜敏敏, 周明, 鄧磊,等. 番茄分子育種現狀與展望——從基因克隆到品種改良[J]. 園藝學報, 2017,44(003):581-600.
[7]. Li S ,Chen K , Grierson D . A critical evaluation of the role of ethylene and MADStranscription factors in the network controlling fleshy fruit ripening[J]. NewPhytologist, 2018, 221(4).
[8]. Vrebalov,J. A MADS-box gene necessary for fruit ripening at the tomatoripening-inhibitor (rin) locus.[J]. Science, 2002, 296(5566):343-346.
[9]. Shan, Li,Huijinlan, et al. TheRIN-MCFusion of MADS-Box Transcription Factors HasTranscriptional Activity and Modulates Expression of Many Ripening Genes[J].Plant Physiology, 2017.
[10].Giovannoni J J , Noensie E N , Ruezinsky D M , etal. Molecular genetic analysis of theripening-inhibitor andnon-ripening loci oftomato: A first step in genetic map-based cloning of fruit ripening genes[J].Molecular & General Genetics Mgg, 1995, 248(2):195-206.
[11].Ying G , Wei W , Zhongqi F , et al. Re-evaluationof the nor mutation and the role of the NAC-NOR transcription factor in tomatofruit ripening[J]. Journal of Experimental Botany, 2020.
[12].Jiang G , Zeng J , Li Z , et al. Redox Regulationof the NOR Transcription Factor Is Involved in the Regulation of Fruit Ripeningin Tomato[J]. Plant physiology, 2020, 183(2):pp.00070.2020.
[13].Kenneth Manning,Mahmut Tör,Mervin Poole,YiguoHong,Andrew J Thompson,Graham J King,James J Giovannoni,Graham B Seymour. Anaturally occurring epigenetic mutation in a gene encoding an SBP-boxtranscription factor inhibits tomato fruit ripening[J]. NatureGenetics,2006,38(8).
[14].S, Moore. Use of genomics tools to isolate keyripening genes and analyse fruit maturation in tomato[J]. Journal ofExperimental Botany, 2002, 53(377):2023.
[15].Lü, Peitao, Yu S , Zhu N , et al. Genome encodeanalyses reveal the basis of convergent evolution of fleshy fruit ripening[J].Nature Plants, 2018, 4(10):784-791.
[16].Barry, Cornelius, S, et al. EthyleneInsensitivity Conferred by the Green-ripe and Never-ripe 2 Ripening Mutants ofTomato.[J]. Plant Physiology, 2005.
[17].Qian Ma,Wenyan Du,Federica Brandizzi,James J.Giovannoni,Cornelius S. Barry. Differential Control of Ethylene Responses byGREEN-RIPE and GREEN-RIPE LIKE1 Provides Evidence for Distinct EthyleneSignaling Modules in Tomato[J]. Plant Physiology,2012,160(4).
[18].Xiaoqi, Pan, Benzhong, et al. iTRAQ ProteinProfile Analysis of Tomato Green-ripe Mutant Reveals New Aspects Critical forFruit Ripening[J]. Journal of Proteome Research, 2014, 13(4):1979-1993.
[19].劉昕,陳韻竹,Kim Pyol,KimMin-Jun,Song Hyondok,李玉花,王宇.番茄果實顏色形成的分子機制及調控研究進展[J].園藝學報,2020,47(09):1689-1704.
[20].Pankratov, I., McQuinn, R., Schwartz, J., Bar,E., Fei, Z., Lewinsohn, E., Zamir, D., Giovannoni, J. J., and Hirschberg, J.2016. Fruit carotenoid-deficient mutants in tomato reveal a function of theplastidial isopentenyl diphosphate isomerase (IDI1) in carotenoid biosynthesis.Plant J. 88: 82–94.
[21].Ronen, G., Carmel-Goren, L., Zamir, D., and Hirschberg, J. 2000. Analternative pathway to beta-carotene formation in plant chromoplasts discoveredby map-based cloning of beta and old-gold color mutations in tomato. Proc.Natl. Acad. Sci. USA. 97: 11102–11107.
[22].Fray, R. G., and Grierson, D. 1993. Identification and geneticanalysis of normal and mutant phytoene synthase genes of tomato by sequencing,complementation and cosuppression. Plant Mol. Biol. 22: 589–602.
[23].Isaacson, T., Ronen, G., Zamir, D., andHirschberg, J. 2002. Cloning of tangerine from tomato reveals a carotenoidisomerase essential for the production of beta-carotene and xanthophylls inplants. Plant Cell. 14: 333–342.
[24].Galpaz, N., Ronen, G., Khalfa, Z., Zamir, D., and Hirschberg, J.2006. A chromoplast-specific carotenoid biosynthesis pathway is revealed bycloning of the tomato white-flower locus. Plant Cell. 18: 1947–1960.
[25].Ronen, G., Carmel-Goren, L., Zamir, D., and Hirschberg, J. 2000. Analternative pathway to beta-carotene formation in plant chromoplasts discoveredby map-based cloning of beta and old-gold color mutations in tomato. Proc.Natl. Acad. Sci. USA. 97: 11102–11107
[26].Neuman, H., Galpaz, N., Cunningham, F. X., Zamir, D., andHirschberg, J. 2014. The tomato mutation nxd1 reveals a gene necessary forneoxanthin biosynthesis and demonstrates that violaxanthin is a sufficientprecursor for abscisic acid biosynthesis. Plant J. 78: 80–93.
[27].Cookson, P. J., Kiano, J. W., Shipton, C. A., Fraser, P. D., Romer,S., Schuch, W., Bramley, P. M., and Pyke, K. A. 2003. Increases in cellelongation, plastid compartment size and phytoene synthase activity underliethe phenotype of the high pigment-1 mutant of tomato. Planta 217: 896–903.
[28].Mustilli, A. C., Fenzi, F., Ciliento, R., Alfano, F., and Bowler, C.1999. Phenotype of the tomato high pigment-2 mutant is caused by a mutation inthe tomato homolog of DEETIOLATED1. Plant Cell. 11: 145–157.
[29].Galpaz, N., Wang, Q., Menda, N., Zamir, D., and Hirschberg, J. 2008.Abscisic acid deficiency in the tomato mutant high-pigment 3 leading toincreased plastid number and higher fruit lycopene content. Plant J. 53:717–730.
[30].Efremov G I , Slugina M A , Shchennikova A V , etal. Differential Regulation of Phytoene Synthase PSY1 During FruitCarotenogenesis in Cultivated and Wild Tomato Species (Solanum sectionLycopersicon)[J]. Plants, 2020, 9(9).
知識積累部分引自：wangchuang2017、weixin_34354945、CGMonline
侵刪
才疏學淺，錯誤之處再所難免
歡迎留言批評指正
如需交流可添加我的個人微信
yy745157813
感謝你看到最後
願你度過美好的一天
複製下列連結或點擊閱讀全文
可獲得本文相關文獻和附件
連結: https://pan.baidu.com/s/16fc9hZFngu1xwkYIM578_Q
提取碼: byw8