▉ 原文信息
今天給大家帶來一篇有關靶向蛋白降解(targeted protein degradation, TPD)技術的綜述文章，原文信息如上圖。本綜述全面概述了化學生物學和藥物發現的各種TPD技術，並從藥物化學家的角度分析了它們的優勢和局限性。
▉ 前言
1975年，美國科學家Gideon Goldstein和同事從胸腺中分離得到一種由76個胺基酸組成的小肽。起初他們誤以為這是一種胸腺激素，但隨後發現這種蛋白質廣泛存在於組織和真核生物中，「泛素」(ubiquitin, 來自拉丁文ubique: 處處，到處)由此得名。1977年，HarrisGoldknof和Ira Bush在細胞周期的研究中發現，在染色體的組蛋白H2A中與其異肽鏈共價結合的分子即是泛素。次年，受到Goldberg等人關於「ATP依賴性的蛋白分解系統」等相關論文的啟發，Avram Hershko、Aron Ciechanover與Irwin Rose等從網織紅細胞中分離得到活性組分APF-1 (active principle in fraction 1)，後來經證實APF-1與之前發現的泛素是同一種物質。
此後，經過多年的研究，人們逐漸了解了人體內經泛素介導的蛋白降解途徑(圖1-a)，即泛素通過E1(泛素活化酶)、E2(泛素結合酶)、E3(泛素連接酶)的多級反應與底物蛋白共價結合，隨後含有泛素標記的蛋白被蛋白質水解酶體(Protease)識別並分解。2004年，由於Avram Hershko、Aron Ciechanover與Irwin Rose三位科學家在「泛素調節的蛋白質降解」領域的卓越貢獻，被授予了諾貝爾化學獎。
在此基礎上，發展出了靶向蛋白降解(targeted protein degradation, TPD)技術，並在過去的幾十年中，在化學生物學和藥學領域中得到廣泛研究與應用。
圖1. a) 泛素介導的蛋白降解途徑；b) 細胞內天然蛋白質的降解方式；c) E3泛素連接酶複合體的結構。
細胞內天然蛋白質的降解主要通過以下兩種方式：泛素-蛋白酶體系統(ubiquitin-proteasome system, UPS)和自噬-溶酶體途徑 (圖1-b)。在E1、E2、E3酶的作用下，通過共價結合的方式蛋白質被打上泛素標記，隨後被細胞內的溶酶體分解。泛素包含七個用於形成多聚泛素鏈的賴氨酸殘基(Lys6、Lys11、Lys27、Lys29、Lys33、Lys48和Lys63)。其中Lys48和Lys11介導連結的泛素鏈主要被蛋白酶體降解，而Lys63介導連結的泛素鏈則更易於通過自噬途徑降解。26S蛋白酶體能夠有效降解短壽命、可溶性的未摺疊或錯誤摺疊的蛋白質和多肽，自噬-溶酶體途徑則負責降解長壽命的蛋白質、不溶的蛋白質聚集體和功能異常的細胞器(變性的線粒體)。
泛素化是蛋白酶體降解和自噬降解的核心機制，而E3泛素連接酶是泛素化級聯反應的核心部分。人體中有600多種基因可以編碼E3泛素連接酶，且E3酶具有嚴格的空間與底物特異性，這有助於泛素化系統的特異性和複雜性。根據組成結構的不同，E3酶主要包括以下幾類：RING (really interesting new gene)型、Cullin-RING型、U-Box型和HECT(homologous to the E6-AP carboxyl terminus)型，不同類型的E3酶發揮著不同的泛素連接機制。其中，數目最多的超家族是Cullin-RING型E3酶，它們由四個主要成分組成(圖1-c)：發揮支架作用的Cullin蛋白、與E2酶結合的RING finger蛋白、識別靶標的受體蛋白和將受體與Cullin蛋白連接的銜接蛋白。迄今為止，僅有1%的E3連接酶被發現，且開發的主要是Cullin-RING型E3酶。在目前已被開發的Cullin-RING型E3酶中，按受體蛋白的不同主要可分為Cereblon (CRBN)、von Hoppel Lindau (VHL)、inhibitor ofapoptosis protein (IAP)和mouse double minute 2 (MDM2)四種。在人體中，這些受體蛋白與相應的內源性底物特異性結合併誘導它們的降解，平衡相關底物在胞內的含量。綜上，通過人為地對目標蛋白(protein of interest, POI)進行修飾或設計雙功能小分子，使受體蛋白與POI結合，隨後利用泛素-蛋白質降解系統降解POI的過程就是TPD技術。
▉靶向蛋白降解技術(TPD)的分類
圖2. 靶向蛋白降解技術的種類
如上所述，TPD技術主要分為兩大類(圖2)：通過基因編輯技術對POI進行定向修飾的降解標記蛋白(degradation of taggedtarget proteins)類，和設計雙功能小分子的降解非標記蛋白(degradation ofuntagged target proteins)類。
由於需要基因編輯技術的參與，這使得降解標記蛋白技術目前只能作為工具用於生化或醫學等領域的研究。與之相反，降解非標記蛋白技術僅通過雙功能分子連接受體蛋白與POI形成複合物即可使POI泛素化並隨之被降解，因此該類技術具有廣大的藥物開發的前景。本綜述評估了不同蛋白降解技術的特點，並歸納得到如上表格。
如表所示，目前最具發展潛力的TPD技術為PROTACs(Proteolysis-targetingchimeras) 和分子膠水(Molecular Glue)。
PROTACs，即蛋白降解靶向嵌合體，是所有的TPD技術中是最具有成藥可能性的。PROTACs一般由三部分組成：POI結合部分、Linker和E3酶受體蛋白結合部分(如上圖)。目前，靶向不同POI的PROTACs已被廣泛報導，如BRD4、BTK、BCR-ABL、PDEδ等。這些PROTACs主要使用沙利度胺類小分子(CRBN targeting)和羥脯酸類擬肽(VHL targeting)作為受體蛋白結合部分。
圖3. a) 100 nM的dBET1在18小時內能將MV4-11細胞中87％的BRD4降解掉，而差向異構體dBET1(R)則沒有活性；b) ARV-825在結構上與dBET1類似，就誘導BRD4降解而言，其效力比dBET1高10倍[1]。
基於PROTACs介導的蛋白質降解的巨大成功，由Arvinas®開發的兩種PROTAC，ARV-110和ARV-471已於2019年進入臨床試驗，分別針對雄激素受體和雌激素受體。由Arvinas®發表的人體內PK數據的結果顯示，它們的半衰期長達24小時甚至數天之久，預計將於2020年發布臨床療效數據。儘管PROTACs已表現出顯著的有效性，但是仍有許多不足的地方需要解決。
1. PROTACs分子量一般在700~1200之間，這使得它們的透膜能力與(口服)生物利用度較差，且缺少如適用於小分子藥物的「類藥五原則」的預測模型，這使得目前大部分的研究僅僅證明了所設計的PROTAC在細胞水平上對靶蛋白降解的有效性與抗增殖活性。2. 與傳統小分子藥物不同，目前尚無有效的高通量篩選技術用於快速、大量地評估PROTAC降解POI的能力，只能通過細胞活性篩選或免疫印跡實驗等方法實現，這大大降低了開發PROTAC的速度與成功率。
3. 有文獻報導，僅僅改變linker的長度或結構就會對PROTAC的降解能力有巨大影響(圖 3)，這或許是由於在泛素化過程中不同的E3酶和POI之間所需的空間距離不同引起的。鑑於目前仍沒有POI-Protac-E3酶複合物的晶體結構被解析得到，因此對linker部分的改造缺少指導方向。
4. 發現與E3酶受體蛋白特異性結合的底物具有偶然性，目前報導的PROTAC主要靶向CRBN與VHL，儘管CRBN與VHL是否會發生突變以及突變後是否對PROTAC有影響還是未知，但了解新的E3酶並開發相應的PROTAC具有重要意義，也面臨巨大挑戰
圖4. PROTAC研發過程所需的測試與篩選流程
此外，本綜述歸納並建議了PROTACs研發過程中需要進行的測試與篩選流程，如圖4所示。
分子膠水的原理其實與PROTAC相同（如上圖）。與PROTAC相比，分子膠水具有更小的分子量也更像目前常用的小分子藥物，但是分子膠水的發現也更具有偶然性，目前僅有少量分子膠水介導的蛋白-蛋白相互作用被報導。
王少萌等[2]，在試圖優化基於CRBN的MDM2雙功能降解劑時，通過對分子結構進行微小的變化，得到了能夠選擇性降解翻譯終止因子GSPT1的分子膠水。Nomura等[3]在對聚酮類天然產物manumycin的研究中發現，manumycin A與anumycin可以通過共價結合E3泛素連接酶UBR7與蛋白TP53，從而發揮抗增殖活性(引自公眾號「王初課題組」2020年6月29日文)。Ebert等[4]通過篩選得到了CDK抑制劑(R)-CR8，結果表明CR8的嘧啶並咪唑母核能夠與CDK12-cyclin K特異性結合，末端苯連吡啶則能很好地結合DDB1蛋白(銜接蛋白)，從而形成CUL4-RBX1-DDB1-CR8-CDK12-cyclinK複合物並誘導cyclin K的降解。該研究表明，修飾結合靶標的小分子的表面暴露區域是一種合理的策略，可用於開發特定蛋白質靶標的分子膠水降解劑(引自公眾號「王初課題組」2020年6月14日文)。
總之，由於分子膠水的小分子性質和類藥物特性，分子膠水在治療領域的應用具有巨大潛力，但距離廣泛開發仍有很多問題亟待解決。
▉ 總結與展望
以傳統的「佔據學說」(occupation theory)為指導策略發現小分子藥物已經獲得巨大成功，但是由於人體內大部分蛋白缺乏結合口袋，使得許多蛋白成為了「undruggable target」。靶向蛋白質降解(TPD)技術通過劫持內源蛋白質降解機制來誘導致病蛋白質的耗竭或減少，提供了一種新穎的治療方法。由於TPD僅需要以中等的結合能力募集POI，而非高親和力的小分子，即可通過循環催化降解的方式分解目標蛋白，因此理論上也能夠降解這些「undruggable target」(主要包括轉錄因子、僅發揮骨架功能的蛋白等)，具有巨大的藥用潛力。除此以外，TPD還是有價值的化學生物學工具，可用於驗證靶標並加深對蛋白質功能和細胞途徑的了解。
「鑑於生物製劑的成功和基於核苷酸的療法的新興進展以及即將到來的基因療法，小分子藥物一直在尋找自己的解決方案，以解決「undruggable target」的問題。TPD技術有助於填補這一空白，它提供了一種基於藥物化學方法的解決途徑，該技術可與過去幾十年中出現的許多新模式競爭。在該行業內，形成了類似淘金熱的氛圍，TPD是否能夠實現其較高的期望尚待觀察。但是，這絕對是在TPD技術的基礎上開展工作並積極塑造下一代小分子藥物的絕佳時機。」
參考資料:
[1] Toure M.,Crews C. M. Small-Molecule PROTACS: New Approaches to Protein Degradation [J]. Angew Chem Int Ed Engl, 2016, 55(6): 1966-73.
[2] Yang J.,Li Y., Aguilar A., et al. SimpleStructural Modifications Converting a Bona fide MDM2 PROTAC Degrader into aMolecular Glue Molecule: A Cautionary Tale in the Design of PROTAC Degraders[J]. J Med Chem, 2019, 62(21): 9471-87.
[3] Isobe Y.,Okumura M., McGregor L. M., et al.Manumycin polyketides act as molecular glues between UBR7 and P53 [J]. Nat Chem Biol, 2020,
[4] SlabickiM., Kozicka Z., Petzold G., et al.The CDK inhibitor CR8 acts as a molecular glue degrader that depletes cyclin K[J]. Nature, 2020,