在探究分子機理的過程中傳統生物化學手段只能提供一個平均結果，難以探測中間狀態以及並不清楚單個分子機制。這種傳統生物學手段放棄了個體差異，雖然這種差異可能不重要，但是丟棄的信息可能是基本機制的關鍵。單分子生物物理的出現解決了這一問題，其最大的優點在於直接觀察每一個分子的反應軌跡，消除平均帶來的模糊。單分子生物物理是指利用物理學的技術手段來研究單個生物大分子，是介於物理、化學、生物交叉領域的前沿技術。其中涉及單分子螢光成像和單分子力學操縱兩方面。
螢光成像是研究細胞、亞細胞結構以及生物大分子的重要手段。單分子螢光成像可追溯於1989年首次實現在固體4K低溫下的單分子螢光探測[1]，後來發展至室溫。單分子螢光檢測能夠實現生物大分子的定位,即通過對生物大分子進行螢光標記而實現追蹤定位。2003年實現了單納米精度的螢光成像（fluorescence imaging withone-nanometer accuracy, FIONA）[2]，通過對單個螢光團成像進行二維高斯擬合，從而實現1nm分辨精度觀察分子馬達肌球蛋白V的步行。
其次，偏振全內反射螢光顯微術（polarizedtotal internal reflection fluorescence microscopy, polTIRFM）能夠檢測單個螢光標記分子的空間取向和旋轉動態。
第三，兩個螢光團（受體和供體）之間的距離可以通過測量螢光共振能量轉移效率而得到，從而實現單分子螢光成像生物大分子相互作用的觀測。單分子螢光共振能量轉移技術[3]是指雷射激發供體螢光分子，當受體分子靠近供體小到一定距離時，供體螢光分子的激發能量通過誘導的偶極相互作用傳遞給受體分子，受體分子發光。能量傳遞效率E與距離R有關，可以測量的距離範圍為3~8nm。
以上是目前常用的單分子螢光成像技術。關於單分子操縱技術，包括玻璃微針、原子力顯微鏡[4]、磁鑷[5]和光鑷[6]等。玻璃微針是將針尖進行生物修飾使之可以操縱生物大分子。原子力顯微鏡是通過針尖來控制生物大分子與平臺表面的距離，檢測力的大小，或者實現在某力下的操作。磁鑷是把生物大分子一端連接在載玻片上，另一端連上超順磁性小球，通過改變外磁場來拉伸或轉動超順磁性小球，從而操控生物大分子。光鑷是利用聚焦雷射束產生輻射壓力而形成光學陷阱,處在陷阱中的微粒因受到梯度力場的作用而被鉗住，通過移動光束可以操縱微粒，進而操縱連接在微粒上的生物大分子。
單分子技術推動了生物大分子動力學過程和構象變化的研究，開闢了單分子生物物理的時代。目前，不斷提升成像精度，以及實現力學操縱和實時的螢光成像是單分子技術發展的前沿。以下對於2010年至2017年間單分子技術的推動做一個簡單的回顧，其中包括力學操縱和成像的結合以及單分子技術分辨精度的提升。
1、2010年實現磁鑷與螢光共振能量轉移技術的結合。研究案例為B-DNA與Z-DNA之間的轉換：B-DNA是廣泛被認知的DNA右手雙螺旋結構，Z-DNA是左手雙螺旋結構。通過磁鑷對B-DNA進行負超螺旋化操縱，觀測螢光共振能量轉移效率的變化。
（來源文獻[7]）
2、2012年發展了原子力顯微鏡和螢光共振能量轉移結合。研究案例為HPPK蛋白的構象變化：對單個HPPK蛋白分子進行外力拉伸，原子力顯微鏡得到力譜曲線，同時螢光共振能量轉移技術實時觀測了HPPK蛋白構象的改變。
（來源文獻[8]）
3、2015年光鑷與螢光共振能量轉移技術實現了結合研究，研究案例是UvrD解旋酶。蛋白的功能和三維結構之間的關係對於理解蛋白的作用機理是十分必要的。蛋白質執行某一功能，對應動態結構的改變，對於大多數技術是不能夠直接觀測的。即便是高精度的冷凍電鏡技術也是由靜態圖片得到結構信息，相對應的動態功能只能夠進行推測而不能直接觀測。而光鑷結合螢光共振能量轉移技術可以進行實時動態研究。以UvrD解旋酶為例，光鑷結果記錄了UvrD解旋的過程，螢光共振能量轉移同時監測了UvrD構象的改變。該實驗首次記錄了蛋白質功能和構象的實時變化。
（來源文獻[9]）
4、2013年採用光鑷與DNA Origami（緊緻的DNA束）結合來穩定研究的生物系統，提高光鑷解析度。一般光鑷研究的生物系統是通過DNA雙鏈作為手柄連接到微粒小球上。當手柄由雙鏈DNA換做更為緊緻的DNA Origami時，增加了系統的穩定系，提高解析度。
5、2017年發展了高精度螢光共振能量轉移技術。以往的螢光共振能量轉移技術在對於解旋酶研究上只能達到2-3bp的分辨精度，而2017年發展的納米張力器技術，通過對單鏈核苷酸鏈施加一小段雙鏈DNA的剛性彈力作用，使得螢光共振能量轉移技術在對解旋酶研究上提高到0.5個鹼基對的精度，促進對解旋酶和聚合酶更統一、更基礎的分子機制研究。
(來源文獻[10])
單分子生物物理技術的發展極大促進了對生物大分子的研究，促進在分子層面上對生命問題的研究。單分子生物物理技術的劣勢在於局限於在體外對生物大分子研究，更複雜的細胞內的研究依賴於其它技術。未來，能夠利用單分子技術研究各樣的生物系統成為重中之重。
參考文獻：
[1] Moerner WE and Kador L.Optical detection and spectroscopyof single molecules in a solid. Phys.Rev.Lett. 62:2535-2538.1989
[2]Yildiz,A. et al. Myosin V Walks Hand-Over-Hand: Single Flurophore Imaging with 1.5-nmLocalization. Science (80-. ). 300, 2061–2065 (2003).
[3]Ha T, et al., Probing the interaction between two single molecules:fluorescence resonance energy transfer between a single donor and a singleacceptor. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93 (13): 6264–8. 1996
[4]G. Binnig, Ch. Gerber and C.F. Quate, Phys. Rev. Lett. 56, 930.1986
[5]Smith S B, Finizi L, Bustamante C et al., Science, 256:1122.1992
[6]Ashkin A, et al., Observation of a single-beam gradient force optical trap fordielectric particles. Opt. Lett. 11 (5): 288–290.1986
[7]Mina Lee, Minute negative superhelicity is sufficient to induce the B-Ztransition in the presence of low tension, PNAS,vol. 107, no. 11,4985–4990,2010
[8]Yufan He;Maolin Lu;Jin Cao;H. Peter Lu.Manipulating Protein Conformations by Single-Molecule AFM-FRET Nanoscopy.ACSNANO,6,1221–1229(2012)
[9]Matthew J. Comstock, Direct observation of structure-function relationship in anucleic acid–processing enzyme,Science,2015
[10]Wenxia Lin, Jianbing Ma, Daguan Nong, et. al,「Helicase stepping investigatedwith one-nucleotide resolution fluorescence resonance energy transfer」,Physical Review Letters 119 (13), 138102
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