高效液相色譜的定性定量分析 EWG1990儀器學習網

2020-12-17 儀器學習

2019-07-11作者:EWG1990儀器學習網

、定性分析

在高效液相色譜中,常用的定性分析有下列五種方法。

1、利用已知標準樣定性

由於每一種化合物在特定的色譜條件下有其特定的保留值,如果在相同的色譜條件下,被測物與標樣的保留值相同,則可初步認為被測物與標樣相同。

2、利用紫外和螢光光譜定性

由於不同的化合物有其不同的紫外吸收或螢光光譜,對檢測池中的待檢樣品進行全波長(180~800nm)掃描,得到紫外可見光或螢光光譜圖;再用相應標準品,按同樣方法處理,也得到一個光譜圖,比較這兩張圖譜,即可鑑別該樣品是否與標準品相同。對於某些有特徵光譜圖的化合物,也可以與所發的標準圖譜來比較以進行定性。

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3、收集柱後流出組分,再用其他化學或物理方法定性

液相色譜常用化學檢測器,被測物經過檢測器後不受破壞,所以可以收集各組分,然後再用紅外光譜、質譜、核磁共振等方法進行鑑定。

4、HPLC 指紋圖譜分析法

HPLC 指紋圖譜分析法是指紋圖譜與 HPLC 相結合的一種分析方法,目前已成為中藥質量控制的首選方法,適用於中藥複雜成分的分離、分析和指紋圖譜的建立。在食品上主要用於天然成分的分析。被分離、分析物質預處理後用HPLC 測定出色譜峰,經過計算機庫存信號的檢索及對質譜圖的解析,對所含成分做出定性鑑定。

5、建立液相色譜定性方法

可根據以下幾點,建立合理的液相色譜分析方法:選擇合適的分析樣品的液相色譜方法;選擇合適的柱子;選擇合適的k(峰容量因子)的條件;確定良好的峰位(α);選擇良好的柱條件(最佳 N 值)。

根據樣品的情況,如分子量是大於2000還是小於2000,樣品是溶於水還是不溶於水,確定選擇何種液相方法。見下圖。

選擇溶劑強度配成適宜的流動相,以得到理想的k,使k儘量在1~10的範圍內(特殊情況也允許0.5<k<20)。溶劑的黏度也很重要,一般黏度要小於2×10-3Pa·s。

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二、定量分析

在高效液相色譜分析中常用的定量分析方法有外標法和內標法。

1、外標法

外標法是以被測化合物的純品或已知其含量的標樣作為標準品,配成一定濃度的標準系列溶液,注入色譜儀,得到的響應值(峰高或峰面積)與進樣量在一定範圍內成正比。用標樣濃度對響應值繪製標準曲線或計算回歸方程,然後用被測物的響應值求出被測物的量。

2、內標法

內標法是在樣品中加入一定量的某一物質作為內標進行的色譜分析,被測物的響應值與內標物的響應值之比是恆定的,此比值不隨進樣體積或操作期間所配製的溶液濃度的變化而變化,因此可得到較準確的分析結果。

具體操作步驟如下。

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(1)先準確稱取被測組分 a 的標樣 Wa內標物,加入一定量溶劑混合,即得混合標樣。取任意體積(μL)注入色譜儀,得色譜峰面積Aa(被測組分a標樣峰面積)及峰面積As(內標物峰面積),用下式計算相對響應因子Sa。

(2)稱取被測物W,然後加入準確稱重的內標物W's,加入一定體積的溶劑混合。取任意體積(μL)注入色譜儀,測得被測組分a的峰面積A'a,內標物峰面積為A's。按下式計算被測物中 a 組分的質量W'a。

a 組分在被測物中的含量為:

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