Mol Plant|電子科技大學張勇及馬裡蘭大學YiPing Qi組報導了基於Prime Editing的植物基因組編輯新系統

2021-02-16 植物科學最前沿

2020年3月26日，Molecular Plant 在線發表了電子科技大學張勇課題組及馬裡蘭大學Yiping Qi題為「Plant prime editors enable precise gene editing in rice cells」的研究工作，報導了」Prime Editing（PE）」策略介導的植物基因組編輯新系統，基於水稻基因組多基因多位點通量數據分析基礎上，對其編輯活性、編輯特性等關鍵問題進行了解讀，為PE基因組編輯系統在植物中的有效應用提供了基礎工具及實施方案，進一步拓展了植物基因組編輯工具箱。

https://www.cell.com/molecular-plant/fulltext/S1674-2052(20)30072-1

自2012年以來，基於CRISPR-Cas的基因組編輯系統以前所未有的廣度、深度影響了生命科學及相關學科的基礎研究及應用實踐，但目前主要的基因組編輯類型依然是在CRISPR-Cas定向剪切基因組DNA後，基於非同源末端連接（nonhomologous end joining，NHEJ）修復途徑實現的序列缺失、插入突變。由於大部分多細胞真核生物，特別是高等植物細胞另一DNA斷裂修復途徑，同源重組（homologous recombination，HR），效率較低，基於CRISPR-Cas編輯系統的精準序列替換編輯事件實現較為困難，極大限制了基因組編輯技術有效應用。近年來，通過融合不同類型脫氨酶結構域，研究者開發了」C to T」、」A to G」的CRISPR-Cas單鹼基編輯工具，一定程度上彌補了現有基因組編輯工具的短板，但並沒有有效解決對全基因組無差別精準編輯的實際需要，因此開發更加高效且廣譜的精準基因組編輯工具一直是研究者努力的重要方向。

2019年末，研究者以CRISPR-Cas9系統為基礎，將M-MLV RT逆轉錄酶與Cas9蛋白（Cas9-H840A：切割PAM位點所在DNA鏈）融合，並在sgRNA序列3』端增加一段RNA序列（修訂後的sgRNA命名為pegRNA），使得Cas9（H840A）：：M-MLV RT逆轉錄酶融合蛋白可以在pegRNA的PBS元件（引物結合位點）引導下，在PAM位點所在DNA鏈切口3』末端引發逆轉錄，並依據pegRNA中RT序列（RT：逆轉錄模板，攜帶有目標點預設編輯序列）進行DNA新鏈合成，進而基於DNA切口修復途徑將預設的編輯鹼基引入基因組，在人源及小鼠細胞中實現了無需DNA模板的全部類型單鹼基替換及多鹼基精準插入、刪除（Anzalone et., 2019）。

基於PE策略可以實現非DNA模板依賴全類型單鹼基替換及多鹼基精準編輯，無疑為基因編輯領域帶來了重大變革。由於動、植物在基因組結構、表達特性及生存環境等的明顯差異，該系統是否可以在植物基因組編輯中有效使用，進一步的編輯效率、編輯模式、位點偏好等植物基因組編輯重要信息均需明確闡釋。電子科技大學張勇教授、馬裡蘭大學YiPing Qi博士課題組，基於此前高效CRISPR-Cas9、CRISPR-Cas12及CRISPR-Cas12b植物基因組編輯系統開發基礎上， 構建了3種不同類型的植物PE基因組編輯新系統(PPE3/b-V01、PPE2-V02、PPE3-V02)，在水稻基因組中明確檢測到pegRNA導向的目標位點全類型鹼基替換、刪除及插入編輯，基於原生質體瞬時編輯系統及高通量測序分析策略，對基於PE策略的植物基因組編輯活性、編輯特性等關鍵問題進行了解讀。

該研究工作，首先針對人源細胞中編輯效率較高的PE3系統，構建了植物Prime Editor版本01（PPE3-V01），其中基於水稻密碼子偏好的Cas9（H840A）：：M-MLV RT融合蛋白由ZmUbi1 Pol II啟動子驅動轉錄，pegRNA及nsgRNA小分子RNA由OsU3、OsU6 Pol III啟動子分別驅動轉錄（圖1A）。針對水稻4個內源基因的5個不同編輯位點，在PBS、RT均為13nt時，基於PPE3-V01系統扼水稻原生質體瞬時表達及高通量測序（HTS）分析，檢測到較低但明確的基於PE策略的編輯活性（0.05-0.15％）（圖1B、1C），初步證實了PE編輯策略在植物細胞中的可實現性。進一步分析HTS測序結果，發現編輯細胞中存在較高比例的長片段缺失編輯事件，推測其可能是由於PE3系統中同時由pegRNA及nsgRNA配對產生了2個切口造成的副產物（圖1C）。

為使此類缺失編輯副產物最小化，並提升PE系統中基於RT模板序列的精準編輯，作者採用PB3b策略，針對水稻5個內源基因，採用多元PBS及RT設計參數（13nt-23nt、不同編輯事件類型），再次明確檢測到基於PE策略的精準編輯事件，基於PPE3b-V01系統的最高編輯效率較PPE3-V01提升了3倍（圖1D），且進一步實現了編輯位點處多鹼基、不連續類型的複雜編輯（圖1E）。

在明確證明植物細胞中PE編輯策略的可實現性基礎上，為了進一步提升編輯效率，作者從Cas9（H840A）：：M-MLV RT融合蛋白密碼優化、表達調控及細胞定位、egRNA及nsgRNA小分子RNA轉錄控制等多個角度進行了基因工程優化，構建了Prime Editor版本02的兩個植物PE系統（PPE2-V02、PPE3-V02）（圖1F）。

針對水稻2個內源基因的25個不同編輯位點，進一步測試了不同PBS長度、RT長度、編輯事件類型、nsgRNA等因素對PE編輯效率的影響。結果表明，相較PPE3/b-V01，PPE2-V02及PPE3-V02編輯系統明確提升了水稻內源基因PE編輯效率，最高PE編輯位點效率為1.55%，但不同位點PE編輯效率明顯受PBS、RT設計參數影響（見上圖1G-1I、1M、1O）。值得注意的是，相較PPE3/b-V01系統，PPE2-V02及PPE3-V02系統在提升PE編輯事件效率的同時，都明顯降低了非PE策略的刪除編輯副產物（圖1J-1L、1N）。進一步，考慮到M-MLV RT可能需要較高溫度體現最佳活性，作者測試了37°C下PPE3-V02系統編輯活性，但與研究中32°C水稻細胞培養條件相較，並未發現編輯效率有明顯提升（附圖2）。

 基於以上研究工作，作者構建了3種不同的植物PE編輯系統（PPE3/b-V01、PPE2-V02、PPE3-V03），進而基於水稻原生質體瞬時表達及HTS通量數據分析，針對水稻基因組多基因多位點，明確證明了PE編輯策略在植物細胞中的可實現性，並對PE編輯系統的植物基因組編輯活性、編輯特性等關鍵問題進行了解讀，拓展了植物基因組編輯工具箱。特別需要指出的是，基於該研究工作，一方面提供了與人源細胞類似的結果（如：目標位點編輯效率明顯依賴PBS、RT、編輯類型、nsgRNA等變量因素），另一方面也明確說明植物系統中PE編輯策略實現存在一定程度特殊性（如：PE2、PE3、PE3b編輯策略對應的編輯活性與人源及小鼠細胞中的結論並不一致），為進一步系統工程優化植物PE基因組編輯系統，提供了明確信息及材料基礎。

 

電子科技大學張勇教授、馬裡蘭大學Yiping Qi博士為該研究工作通訊作者，電子科技大學博士生唐旭、馬裡蘭大學Simon Sretenovic、電子科技大學博士生任秋蓉為論文共同第一作者，研究工作得到了國家轉基因重大專項、國家自然科學基金、四川省青年基金等項目資助。

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