在農業生產過程中,化學肥料和農藥不合理大量使用造成土壤結構的破壞,肥力下降,農作物品質降低。而微生物源的植物生長促進劑能促進植物生長發育,促進土壤良好結構的形成,增加植物和土壤中微生物種類的多樣性且對環境無汙染,無疑這類微生物製劑在農業上的應用是維護農田生態平衡、改善農業生態系統、實現農業可持續發展的有效手段。
一、微生物製劑的分類
當前,促進植物生長的微生物製劑種類較多,也沒有一個統一的分類標準。按照劑型、微生物種類、製劑組成等標準就有不同的分類。我們根據微生物製劑作用於植物體的範圍來劃分,可將其分為三大類:一類屬於土壤微生物的範疇(與植物體沒有直接作用),如解磷、解鉀細菌;第二類屬於根際微生物範疇(與植物根系相互作用),如根瘤菌、聯合固氮菌、PGPR、AM菌根等;另一類屬於植物體自然生態系統範疇,是內生共生菌(intergrowthendophyte),包括內生細菌與內生真菌。
當然,上述分類也不是絕對的,如某些內生真菌偶爾也可由植物地上部分組織轉移定植在根部,但與菌根真菌有區別,因為內生真菌的菌絲不會伸展到根系外部。對於這三大類微生物製劑促進植物生長的機制都不一樣,尤其是植物、內生菌的相互作用(plant-microbe interactions)研究甚少,且不深入,下面就以上三大類微生物製劑的作用機制加以綜述。
二、作用機制概述
1. 有關第一類的解磷、解鉀細菌等微生物製劑已研究較深入,應用也較早。提高土壤中K、P的有效性,使植物體更加有利吸收是促進植物生長、增加其產量的關鍵因素,磷細菌、鉀細菌就能有效地轉化土壤中難溶的P、K,使有機磷、鉀轉化為植物能利用的無機磷、鉀。目前認為,微生物的解磷機制是由於微生物能分泌各類有機酸(檸檬酸、乳酸、甲酸、乙酸等),降低土壤PH值,使難溶性磷酸鹽降解為無機磷,同時可與Fe、Al、Ca等離子結合,從而使磷酸鹽溶解;鉀細菌能對土壤中雲母、長石、磷灰石等含磷、鉀的礦物進行分解。釋放更多的有效P、K。此外,人為在土壤中接種磷細菌、鉀細菌,使之成為優勢菌群,抑制或減少病原微生物的繁殖機會。這方面已有類似綜述。
2. 第二類的根瘤菌、聯合固氮菌、PGPR、菌根真菌(如AM菌根)研究也較多。目前對於根瘤形成的早期過程、階段,根瘤的結構功能,結瘤基因nod,固氮基因nif、 fix的結構功能、調節均研究較清楚。已查明nif固氮基因有10個,fix固氮基因已達16個。同時研究還發現吸氫酶基因、胞外多糖基因和脂多糖基因與共生固氮作用有關。近年來對於根瘤菌與非豆科植物的相互關係也取得一定進展,鍾增濤報導,在有根瘤菌接種的小麥與紫雲英的混作體系中,植株生長得到促進,植株及土壤的全氮均有增加。王逸群報導,將標記基因nifA-lacZ、nifHDK-lacZ,hemA-lacZ通過三親交配導入根瘤菌,再接種水稻,表明在水稻根的細胞間隙和細胞中有根瘤菌的存在。
與根瘤菌的共生固氮不同,聯合固氮菌的宿主範圍較廣泛,如水稻、小麥、玉米等植物的根際,除了固氮,還具有分泌植物激素、維生素、抑制植物乙烯合成等諸多生物學特性。但它大多集中在根表,不形成類似根瘤的共生結構,其固氮活性受到外界環境因子影響很大。近10年來對於聯合固氮菌相關基因的結構功能和表達調控,重組固氮菌的構建以及田間應用都取得重要進展。如葉志華報導:將幾丁質酶基因(chiA)克隆到表達載體PKK223-3和質粒PMC71A上,再將質粒轉化稻根聯合固氮菌E26和NG13中,chiA基因高效表達,使宿主植物在抗病原真菌過程中起重要作用,間接促進植物生長。
PGPR即植物根際促長細菌(plant growth-promoting rhizobacteria)。目前對於PGPR的定義有不同觀點,一般認為PGPR指根圈內存在某些能促進植物生長的細菌,而另一種觀點認為PGPR是指自由生活在土壤或附生於植物根際、莖、葉的促進植物生長的有益菌類,包括細菌、藍細菌。PGPR主要是通過抗生作用抑制植物病原菌和分泌植物激素,間接或直接促進植物生長。關於這方面的研究已有很多報導。
菌根真菌在農業上也得到了大面積推廣,其中應用最廣的是叢枝菌根(AM菌根)。菌根即由植物根系與真菌形成的共生體。最近幾年對菌根真菌的研究主要集中在以下5個方面。
(一)菌根真菌與植物礦質營養
大量文獻已經表明,菌根真菌能改善植物的磷營養,提高N肥的利用率,而且促進植物對微量元素的吸收。王曙光報導,接種VA菌根的茶苗更有利於吸收P、Ca、Mg,且茶苗根際的酸性磷酸酶活性高於CK。Hammad.R報導,在鹽脅迫和非鹽脅迫環境下,接種AMF(Arbusccular Mrcorhizal Fungi)均促進番茄對P、K、Zn、Cu、Fe的吸收。
(二)植物根間菌絲橋的物質傳遞功能及其生態學意義
菌根真菌與植物的互惠共生決定了菌絲必須依靠植物光合產物維持生長,同時它也吸收土壤中的水分和養分,供給植物。所以菌絲橋就成為植物間進行物質循環交流的渠道。由於菌絲橋在養分傳遞中的重要作用,植物群落中植物體間的相互作用變的較複雜,菌絲橋對於群落的組分、結構、穩定性、多樣性都會產生一定影響。
(三)研究菌根真菌與土壤微生物的相互作用
涉及與根瘤菌、聯合固氮菌、解磷細菌的相互作用。M.Marvazquez報導AMF與三種微生物接種劑固氮螺菌屬(Azospirillum)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、木黴屬(Trichoderma)的相互作用以及對玉米根際細菌種群、土壤酶活性的影響,結果表明該三種接種劑對AMF的定植不會產生負面影響,而且玉米根際的脂酶、磷酸酶、海藻糖酶、幾丁質酶的活性均有顯著提高。邢禮軍報導了VA真菌與解磷細菌的協同作用,增強植物對磷的利用率。
(四)菌根真菌的生態學研究
最新研究結果表明,AMF已經進化到包含多個基因組(multiple genomes),AMF與植物通過菌絲橋相互結合,那些不同的基因組潛在地圍繞菌絲橋活動,所以非常有必要研究AMF的種群生態學和遺傳學,以進一步弄清它們與植物是如何協同進化的。Vander heijden在Nature上發表文章,表明AMF的多樣性決定了植物的生物多樣性、生態系統的變異性以及宏觀系統的生產力。總之,菌根真菌與植物間的相互作用在植物個體、植物群落、植物生態系統不同層次均有表現。
(五)菌根真菌提高植物的抗逆性
主要包括耐鹽、耐旱、耐金屬離子毒害。
3. 內生菌與植物間的相互作用。這就是植物微生態學的內容,即研究生物個體內、細胞壁外的微生態環境及其生物之間的相互作用,這是一個非常有意義、非常廣闊又急待研究開拓的新領域。關於內生菌的定義較為混亂,學術界有很多爭論。一般認為,內生菌指在其生活史的絕大部分階段定植在健康植物的根、莖、葉的細胞間隙,形成不明顯感染症狀的一類微生物,通常存在於植物地上部分組織,主要包括內生細菌和內生真菌,也有一部分是卵菌、放線菌。
目前,大多數研究主要集中在內生菌對植物生理特性的影響,主要表現在促進植物分櫱、增加葉綠素含量、提高生物量等,如K.groppe等研究了雀麥生香柱菌(Epichloe bromicola)與直立雀麥(Bromus erectus)的相互作用,包括內生真菌感染的濃度以及外界環境因子對植物生長和開花的影響,用數量PCR技術來評估內生真菌的濃度,結果顯示:植物的營養勢與內生真菌感染的濃度直接相關,在高濃度下,能促進植物的葉片長度、分櫱數以及地上部分生物量。而且在提高外界環境CO2的濃度時,對內生真菌的繁殖更加有利。南志標也報導,感染內生真菌的布頓大麥草的總生物量、根乾重、分櫱數均比對照組有顯著增加。此外,YuXM.等建立了金錢蓮與內生真菌的共培養系統,研究它們之間的相互關係。但對上述報導的深層次的機理探討極少。現加以概述。
(一)內生菌的生物固氮作用(主要是內生細菌)
固氮內生菌主要包括兼性固氮細菌和專性固氮細菌,前者在根表、根內都表現出活躍的生存狀態,而後者只能在植物組織內部定植,在質外體空間表現生理活性,在土壤中難以存活。內生菌固氮作用的發現無疑為豆科植物的共生固氮提供了一條新思路。LaurenD.B.報導,通過GUS報告基因檢測到了內生菌-塞魯普蒂卡草螺菌(Herbaspirium Seropedicae)在禾本科植物根、莖、葉均表達nif基因。
(二)提高植物對土壤N、P、K的吸收
有研究表明,對益微(主要指內生共生芽孢桿菌)處理種子後,對棉花的不同生育期測定,土壤中速效N、P、K均有所提高。同時土壤中鹼性磷酸酶、脲酶、蔗糖酶活性均增強,至於機理尚不清楚。J.R.Barrow的研究結果也顯示,內生真菌能使鹽生灌木有效利用不溶性磷,同時增加根與莖的生物量。Lyons等人發現感染內生真菌的植株的穀氨酸胺合成酶(GS)活性顯著提高,該酶是氨同化過程中重要的酶,可以提高植物對土壤N的利用率。Alejandro等人已經將GS酶純化。最近我們的一項研究表明,發現接種B3菌株的水稻葉片的葉綠素含量要高於對照組,推測可能與上述因素有關。
(三)激素作用
很多文獻報導內生菌能分泌植物激素對植物生長起調節作用,如IAA、乙烯、CTK、GA等。如假單胞菌屬(Pseudomonas)、腸桿菌屬(Enterobacter)、葡萄球菌屬(Staphylococcus)、固氮菌屬(Azobacter)和固氮螺菌屬(Azospirillum)。我們最近一項研究也表明,從大戟科植物中篩選到一株B3菌株,經研究分析,確實能分泌IAA和ABA。同時接種內生菌對植物體內源激素也產生一定影響。有研究表明,益微處理後,棉葉中玉米素Z、異戊烯基腺嘌呤均有增加。內源激素的改變,將對植物整個生長發育和生理代謝產生積極影響。
(四)抗性生理(包括生物脅迫和非生物脅迫)
與作物抗逆性有關的酶主要是SOD酶和POD酶,它們是植物體內清除活性氧的主要物質。吳藹民等報導,在接種內生菌73a後,棉株體內的SOD、POD酶活性較對照明顯上升。SDS-PAGE凝膠電泳分析SOD同工酶,發現比對照組增加了一條譜帶。另外,內生真菌也可增加宿主植物的抗旱性、滲透脅迫抗性。L.J.Morse研究表明,在水分脅迫下,感染內生菌的植株的地上部分生物量和相對生長速率均要高於對照組。任安芝報導了用浸泡4小時的黑麥草種子進行滲透脅迫實驗,結果表明內生真菌感染(EI)的種子發芽快且發芽率顯著高於未感染組(EF)的種子。陳世萍報導了在水分脅迫下內生真菌感染對黑麥草葉內保護酶系統活力的影響,結果表明在室溫滲透脅迫下,感染植株的SOD活性明顯高於非感染植株,MDA含量大大低於非感染植株。
內生菌對生物脅迫的抗性也有不少報導,主要關於抗病蟲害和抗病原菌方面的研究。Strobel報導了枝頂孢黴屬內生菌(Acremonium sp.)能產生一系列抗卵菌的多肽物質-白灰制菌素。Blanken- ship將一株半知菌類的鉤狀新香蒲屬的內生真菌(Neotyphodiu uncinatum)在組合培養基培養後,通過GC-MS和13C NMR分析確證了含有黑麥草生物鹼。Ponaka V.Reddy等研究發現,內生真菌可表達一種蛋白水解酶All,被認為是抗昆蟲、線蟲及其它病原菌的毒力因子。還有一些內生菌能分泌幾丁質酶,定植在植物體質外體空間,可溶解病原真菌細胞壁。
當然,上述的這些研究報導也大多局限在生理代謝水平上,而很少探討其深層次的機理。很多研究表明,內生真菌與植物形成的共生體會受到宿主植物、內生真菌基因型相互作用以及非生物因素的影響。禾本科植物自身的內生菌與宿生植物基因型緊密相關,因為它們在植物體中是垂直傳播的,但關於基因型是如何影響兩者之間的相互關係還知之甚少。為了更好的了解植物-內生真菌相互協同進化關係,就要考慮環境因子、基因背景以及基因- 環境相互作用是怎樣修飾內生真菌與植物形成的共生體的。下面就是要重點研究的方向:
(一)研究植物體中內生真菌多樣性的程度;
(二)不同的內生真菌、植物基因型是如何影響植物的適度(fitness);
(三)環境因子是如何改變內生真菌、植物相互作用的強度;
(四)內生真菌的生態效應:對植物個體、種群、群落三個水平上的影響;
(五)內生真菌在植物體內生命活動的分子調控研究,如內生真菌侵染後是如何通過一系列的信號傳導而刺激植物抗性的產生;內生真菌在植物細胞間的定植是否會影響植物體本身共質體、質外體的物質運輸等;內生真菌分泌的某些蛋白質(如β-1,6葡聚糖酶)可能在相互作用中扮演重要角色。
(六)植物體對內生真菌生長行為的影響。Franz Hadacek等報導了植物根部碳水化合物對內生真菌生長行為的影響,研究表明內生真菌利用植物體蔗糖和甘露糖將影響內生真菌的生活模式,在濃度較低時,內生真菌更能有效利用,而在高濃度下,抑制它的生長。
值得一提的是,隨著分子生物學技術的迅猛發展,在植物-內生菌的相互作用研究中也進入到了基因水平,即建立了相互作用中轉錄物組的研究方法(interaction transcriptomes)。一般思路是,首先將宿主(host)、相互作用體(interaction)、微生物(microoganism)的RNA提取出來,分別逆轉錄成cDNA,然後通過RNA指紋技術(包括DD RT-PCR和cDNA-AFLP技術)來比較在相互作用過程中宿主與微生物的基因的表達差異情況,某些cDNA(如管家基因)在宿主和微生物中屬於組成型表達,而另外一些cDNA在相互作用中會受到正調節或負調節(up-regulation or down-regulation)。
三、 接種方式、劑型研究及其對微生物製劑的評價
在應用以上微生物製劑的時候,有必要對其接種方式和劑型進行研究,因為使用不同的接種方式與劑型對植物的生長促進作用會有差異。要在農業上大面積推廣微生物製劑,必須對質量控制、降低成本、使用便捷等因素進行考慮。
1. 對於第一類微生物製劑,載體的選擇起關鍵作用。一般用吸水率和有效菌數釋放率兩個標準衡量載體的優劣。研究表明,常用載體的吸水能力比較如下:蔗糖>硅藻土>草炭,而菌體釋放率為硅藻土>草炭>蔗糖。
就製劑劑型而言,主要有以下幾種:固體粉狀草炭劑型、液體劑型、顆粒劑型、凍幹劑型、瓊脂劑型等,各有優缺點。如固氮菌E57-7就不適合於液體方式保存,這樣會導致菌劑的存活能力大大降低。
對於接種方式,田間小區接種實驗表明,在正常施肥條件下,三種施用方法均比對照組有增產作用,但產量有差異:拌種加作底肥>作底肥>拌種。
此外,不同植物基因型、土壤類型、接種劑類型對宿主植物的增產效應也有不同。C.M.VanJuasreld研究了三種不同的固氮菌劑、三種不同的土壤類型、三種不同的大豆基因型的多種組合對大豆產量的影響,結果顯示,不同的組合對於固氮效率、葉片的含氮量、大豆蛋白含量均有顯著差異。
2. 第二大類的菌根真菌劑,目前有三種生產系統:土壤基質培養、非土壤基質培養、無基質培養。各有優缺點,在實際操作中,可根據製劑的使用目的加以選擇。
對於其菌劑的質量評價,一般指菌劑的浸染能力和病原菌的檢查。接種方式可以有以下三個途徑:田間接種、苗床接種、組織培養苗接種。
3. 第三大類的內生菌製劑,目前應用尚少。
當然以上三類微生物製劑的應用並不是獨立的,如AM菌根真菌和解磷細菌的雙接種對磷營養有正交互效應。
隨著分子生物學技術的日益成熟,在基因重組、細胞融合等生物技術的推動下,人們可以按照設想,構建「工程菌」。同樣,對於微生物製劑,可以運用上述技術對其進行改造,使其在生態農業中發揮更大的效益。