Primer-BLAST，在線設計用於聚合酶鏈反應（PCR）的特異性寡核苷酸引物。Primer-Blast 可以直接從 Blast 主頁（ http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/ ）找到， 或是直接用下面的連結進入：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/這個工具整合了目前流行的 Primer3 軟體，再加上NCBI 的Blast 進行引物特異性的驗證。
Primer-BLAST 免除了用另一個站點或工具設計引物的步驟， 設計好的引物程序直接用 Blast 進行引物特異性驗證。並且，Primer-BLAST 能設計出只擴增某一特定剪接變異體基因的引物。Primer-BLAST 有許多改進的功能，這樣在選擇引物方面比單個的用Primer3 和 NCBI BLAST 更加準確。
Primer-BLAST 界面包括了 Primer3 和 BLAST 的功能。提交的界面主要包括三個部分：target template（模板區）, the primers（引物區）, 和 specificity check（特異性驗證區）。跟其它的 BLAST 一樣，點擊底部的「Advanced parameters」有更多的參數設置。（1） 模板（Template）在「PCR Template」下面的文本框，輸入目標模板的序列，FASTA 格式或直接用 Acession Number，如果你在這裡輸入了序列，是用於引物的設計。Primer-BLAST 就會根據你輸入的序列設計特異性引物，並且在目標資料庫（在 specificity check 區選擇）是唯一的。（2） 引物（Primers）如果你已經設計好了引物，要拿來驗證引物的好壞。可以在 Primer Parameters 區填入你的一條或一對引物。並且選擇好驗證的目標資料庫（在 specificity check 區選擇）。根據需要可設置產物的大小，Tm 值等。（3） 特異性（Specificity）在 specificity check 區，選擇設計引物或驗證引物時的目標資料庫和物種。這一步是比較重要的。這裡提供了 4 種資料庫：RefSeq mRNA, Genome (selected reference assemblies), Genome (all chromosomes), and nr (the standard non-redundant database)。前兩個資料庫是經過專家注釋的數據， 這樣可以給出更準確的結果。特別是，當你用 NCBI 的參考序列作為模板和參考序列資料庫作為標準來設計引物時，Primer-BLAST 可以設計出只擴增某一特定剪接變異體基因的特異引物。selected reference assemblies 包括以下的物種：human, chimpanzee, mouse, rat, cow, dog, chicken, zebrafish, fruit fly, honeybee, Arabidopsis, 和 rice。Nr 資料庫覆蓋 NCBI 所有的物種。用人尿嘧啶 DNA 糖基化酶(uracil-DNA glycosylase genes, UNG, GeneID: 7374)的兩個轉錄本序列作為一個例子來分析。UNG1 的序列長一點（NM_003362），UNG2 的序列短一點（NM_080911，註：拿這兩個基因的序列 ClustalW 一下就可以了）。
這裡用 UNG2 的序列設計引物，選擇 RefSeq mRNA database，物種是 Human，其它默認。結果如下圖 A-B 所示，設計的引物只能擴增出 UNG2。看上面的圖，把「Allow primer to amplify mRNA splice variants」這個選項給勾上，出現的結果如下圖-C 所示，新的引物也可以擴增出 UNG1（註：我試了一下，不能得到預期的結果，可能參數沒設對）。Figure. Primer-BLAST results for UNG transcript variant 2. The NCBI Reference sequence NM_080911 was used as a template. Top panel: Primers specific to the single splice variant are reported by default with the mRNA RefSeq database limited to human sequences. Bottom panel: Primers that amplify both splice variants are found with the option to allow splice variants.▼推薦閱讀
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