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DNA甲基化是哺乳類動物一個重要的基因外遺傳信號.有研究表明,DNA甲基化與大多數腫瘤的發生相關,抑癌基因啟動子CpG島的高甲基化可引起抑癌基因表達沉默,細胞出現無節制生長,導致腫瘤的發生[1].目前,甲基化特異性PCR(methylation-specific PCR, MS-PCR)是研究DNA甲基化最為常用且準確度較高的方法之一,而理想的引物設計則是其成功的關鍵因素之一.國外網際網路上有1個提供免費在線引物設計程序「MethPrimer」,它能夠預測CpG島,根據實驗者要求設計硫化測序PCR(bisulfate-sequencing PCR, BSP)和甲基化特異性PCR(methylation-specific PCR,MSP)引物.本研究旨在介紹甲基化特異性PCR引物設計的原則及「MethPrimer」設計程序的使用方法和有關注意事項.
1、材料與方法
1. 1 序列的轉換
DNA經亞硫酸氫鹽硫化處理後,DNA雙鏈中的「C」轉化為「U」,通過隨後的PCR,將「U」轉化為「T」,但亞硫酸氫鹽不能使已發生了甲基化的DNA的「C」發生上述轉化,因此,根據經亞硫酸氫鹽處理的DNA模板設計引物時,先輸入感興趣的DNA序列,程序將會顯示2種序列:一種是輸入的源DNA序列;另一種是硫化處理後的DNA序列,除了CpG島上的5甲基胞嘧啶(5mC)之外,所有非甲基化的「C」都轉換成了「T」,根據轉化後的序列設計引物,進行BSP和MSP.
1. 2 CpG島的預測[2]
哺乳類動物基因組中5% ~10%是CpG(二核苷酸),其中70% ~80%呈甲基化狀態,稱為甲基化的CpG(mCpG).CpG的聚集稱CpG島,已知在所有管家基因和一些組織特異基因的5′端調控區均有CpG島呈高度甲基化,基因組中平均100個bp有1個跨度為0. 5~5 kb的CpG島.
「MethPrimer」設計程序默認的CpG島跨度至少為200 bp,GC含量>50%,CpG出現頻率>0. 6.因此,符合這些參數的區域都默認為CpG島,我們根據任意1個CpG島設計引物進行擴增.
1. 3 BSP的引物設計原則
標準的PCR引物設計原則同樣適用於硫化測序PCR(bisulfite sequencing PCR,BSP),除了標準PCR的一些參數外,「MethPrimer」應用3′端算法計算自身退火溫度、末端退火溫度、鹼基對互補率、GC含量、解鏈溫度(Tm),而且還提供了上遊引物和下遊引物的Tm區別,以及引物中最大允許的單核苷酸重複率.因為所有非甲基化的「C」都被轉換成「T」,所以「MethPrimer」中默認的重複「T」為8個,而其他鹼基重複數為5個.
DNA的完全硫化是很重要的,因此應選擇含儘可能多的非甲基化CpG的「C」區域作為源序列,設計引物.對於BSP,引物設計的原則[1]:①為了區別甲基化DNA和非甲基化DNA,引物不應含有CpG位點;②引物擴增的產物應包含儘可能多的CpG位點.
1. 4 MSP的引物設計原則[3,4]
對於MSP需要設計2對引物,一對是針對於經亞硫酸氫鹽處理的甲基化的DNA;另一對是針對於經亞硫酸氫鹽處理的非甲基化的DNA.根據甲基化的DNA為模板的PCR擴增甲基化的DNA;根據非甲基化的DNA為模板的PCR擴增非甲基化的DNA.MSP引物設計的原則:①為了最大限度的區分甲基化與非甲基化,引物的3′端至少包含1個CpG位點,我們可以自己設定CpG的「C」距3′末端的最遠距離.「MethPrimer」中默認值為3,即是在引物的最後3個鹼基中,至少有1個是CpG的「C」.②引物序列中應包含儘可能多的CpG位點.③甲基化引物和非甲基化引物序列3′端應處於相同的CpG位點.如果,2對引物不在相同的CpG位點退火, PCR結果就不能準確反映樣本DNA甲基化的情況.但是甲基化引物和非甲基化引物可跨越不同的長度,在起始位點和長度上也可以不同.一般非甲基化引物比甲基化引物長,因為受Tm值限制,由於非甲基化引物中的「C」轉化成「T」,導致GC含量降低,從而引起Tm降低.④2套引物應有相近的Tm值,「MethPrimer」中默認2套引物Tm值相差不超過5℃,這種限制可使2個PCR反應在同一PCR儀中進行.
引物的成功設計對於PCR是至關重要的,硫化反應促使DNA鏈中的「C」轉化為「U」,導致GC含量降低,使PCR反應後在序列中出現長的連續「T」,容易引起DNA鏈的斷裂[5, 6].此外,純化過程中的DNA的丟失,也是要考慮的另一個因素,這些因素又會影響下面的PCR的進行,這些都是設計PCR引物時需要考慮的.
一般情況下, PCR產物的長度大於300 bp時,就很難以硫化DNA為模板進行擴增.因此,「MethPrimer」程序設計PCR產物的長度在100~300 bp, 200 bp的長度比較合適.與標準PCR不同的是甲基化PCR引物的長度,甲基化PCR一般需要更長的引物,引物長度在30 bp左右,原因是硫化降低了模板DNA的GC含量,使序列中出現長的連續「T」,導致很難選擇具有合適的Tm值及穩定的引物;另一方面,為了區別硫化處理和沒有硫化處理以及未完全處理的DNA,需要引物有足夠數量的「C」,這些都增加了選擇穩定引物的困難.因此,為了獲得更穩定的雙鏈,選擇更長的引物是有必要的,因為DNA的Tm值取決於引物的長度[7].一般情況下,甲基化PCR引物的長度在20~30 bp.「MethPrimer」默認的引物長度在20~30 bp, 25 bp為最適長度.
「MethPrimer」在設計引物時,不考慮輸入序列中的重複元件和載體序列.因為,對於DNA甲基化的研究,我們一般注重有特點的序列或者序列中確定的區域,大部分這些序列或區域是啟動子序列,因此載體序列不考慮;另一方面,輸入的序列由程序模擬硫化處理發生了轉化,這樣重複的元件不再重複了,即使是引物位置所在的序列在轉化前是重複序列,也不會影響引物的質量.
總之,「MethPrimer」是一個特異性的針對硫化PCRs(BSP和MSP)設計引物的程序,其操作簡便、快速、準確,對於研究DNA甲基化是一個至關重要的工具.目前,「MethPrimer」正在進一步地發展和完善,使它可以設計出更多其他的硫化PCRs的引物.
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