之前介紹過用NBBI在線設計引物的方法（在線設計引物一步到位），今天結合網絡一些資料及自身的經驗詳細介紹了用primer5.0設計PCR引物的一些基本原則以及分享了引物設計的方法步驟與資料，希望對於實驗的同學有所幫助。
一、PCR引物設計原則
1、引物長度一般在15-30bp。
引物長度一般為15-30bp，常用的為18-27bp，但不應大於38bp，因為過長會導致其延伸溫度大於74℃，不適於Taq DNA聚合酶進行反應；
2、引物GC含量一般為40%-60%。
引物GC含量一般為40%-60%，以45-55%為宜，GC含量過高或過低都不利於引發反應。上下遊引物GC含量和Tm值要保持接近；
3、引物所對應的模板序列的Tm值最好在72℃左右。
Tm值在72℃左右可使復性條件最佳，至少要在55-80℃之間。Tm值的計算有多種方法，如按公式Tm＝4(G+C)＋2(A+T)，在Oligo軟體中使用的是最鄰近法(the nearest neighbor method)；
4、引物3』端的鹼基一般不用A。
引物3』端的鹼基一般不用A，因為A在錯誤引發位點的引發效率相對比較高。
5、引物3』端出現3個以上的連續鹼基，如GGG或CCC，也會使錯誤引發機率增加。
6、引物3』端的互補、二聚體或髮夾結構也可能導致PCR反應失敗。
7、如擴增編碼區域，引物3』端不要終止於密碼子的第3位，因密碼子的第三位易發生簡併，會影響擴增特異性與效率；
8、引物5』端可以修飾。
引物5』端序列對PCR影響不太大，因此常用來引進修飾位點或標記物。
9、鹼基要隨機分布，且引物自身和引物之間不能有連續4個鹼基的互補。
引物序列在模板內應當沒有相似性較高，尤其是3』端相似性較高的序列，否則容易導致錯誤引發。降低引物與模板相似性的一種方法是，引物中四種鹼基的分布最好是隨機的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。引物自身不應存在互補序列，否則引物自身會摺疊成髮夾結構（Hairpin）使引物本身復性。這種二級結構會因空間位阻而影響引物與模板的復性結合。引物自身不能有連續4個鹼基的互補。兩引物之間也不應具有互補性，尤其應避免3』端的互補重疊以防止引物二聚體（Dimer與Cross Dimer）的形成。引物之間不能有連續4個鹼基的互補。引物二聚體及髮夾結構如果不可避免的話，應儘量使其△G值不要過高（應小於4.5kcal/mol）。否則易導致引物二聚體帶的 產生，並且降低引物有效濃度而使PCR反應不能正常進行。
10、引物的ΔG值最好呈正弦曲線形狀，即3』端ΔG值較低，而5』端和中間ΔG值相對較高。
ΔG值（自由能）反應了引物與模板結合的強弱程度，一般情況下，引物的ΔG值最好呈正弦曲線形狀，即3』端ΔG值較低，而5』端和中間ΔG值相對較高。3'端的ΔG值相對要低，且絕對值不要超過9，引物的3』端的ΔG值過高，容易在錯配位點形成雙鏈結構並引發DNA聚合反應。
11、引物應在核酸保守區內設計並具有特異性。引物與非特異擴增序列的同源性不要超過70%或有連續8個互補鹼基同源。
二、Real Time PCR引物設計原則
Real Time PCR用引物與普通PCR引物設計要求不同。RealTime PCR是讓目的基因按照理論值進行擴增，對非特異性反應和引物二聚體要求嚴格。
Real Time PCR引物設計原則
擴增片段大小
★
80-150 bp(儘量限制在300 bp以內)
Primer長度
★
17-25 base
GC含量
★
40-60%(最好45-55%)
Tm值
★ ★ ★
兩條引物的Tm值儘量接近，應用專用軟體計算Tm值
序列
★
整體上鹼基不能過偏 個別部分避免GC rich或AT rich(特別是3』端) 避免T/C連續，A/G連續
3'末端序列
★
3』末端避免GC rich或AT rich
3』末端鹼基最好為G 或C
3』末端鹼基儘量避免為T
互補性
★ ★ ★
引物內部或兩條引物之間避免3 base以上的互補序列
引物3』末端避免2 base以上的互補序列
特異性
★ ★ ★
使用BLAST檢索，確認引物特異性
RT-PCR用引物
★ ★ ★
儘量在Exon junction上設計引物，限制基因組DNA擴增
三、常用的引物設計軟體
「Primer premier」，「Oligo」，「Vector NTI Suit」，「DNAsis」，「Omiga」和「DNAstar」。
下面詳細介紹一下Primer 5.0的用法
1、通過File下的New或Open載入需要設計引物的序列
2、進入到程序的引物設計窗口
3、點擊search，則出現新的界面
在新界面設置你需要設計的引物的相關參數。主要有五個要設置的地方。第一個地方是選擇設計PCR引物，測序引物和雜交探針，如果要做PCR就選第一個圈圈「PCR Primers」。第二個地方是搜尋模式，一般我們搜索引物是以對搜索，所以一般選"pairs"。第三個地方是正負鏈的所在區間以及產物的大小長度，這個按自己的需要來，跟實驗目的有關，具體情況具體分析。第四個地方是引物的長度以及正負波動值，一般來說引物長度在18-27範圍內。第五個地方是選擇模式，一般選「Automatic」。設置完上面所說的這些地方後按「OK」鍵，則跳轉到新界面。
4、點擊「OK」，出現如下新界面
顯示結果按照評估分數從高到低向下排列， 一般選取評估分數較高的結果。打分是衡量引物質量的綜合性參數，利用打分系統可以對引物進行有效評估和引物間進行對比選擇提供有效的證據。如果我們只想要尋找正向或反向的引物，就可以選擇「Sense」或「Anti-sense」按鈕。
5、點擊評分高的結果，就可以顯示引物的詳細信息，如下圖。
該圖左上角的兩個按鈕和分別代表的是正向和反向引物。該圖中間部分給出了引物的得分，位置，長度，Tm值，GC含量，自由能等信息。該圖最下面的模塊給出了正反引物是否形成髮夾結構，二聚體，錯配以及引物之間的二聚體等情況，紅色代表有。點擊或我們會看到出現這些結構的具體信息，比如開始的位置，產生的自由能。
6、如果我們對搜索到的引物不滿意，可以手動調整引物的位置，同時可以點擊的按鈕對引物進行修改。如下圖，我們可以增加，刪除或修改鹼基。直到找到最佳的結果。
7、最後將設計好的引物導出或複製出來。
四、推薦幾款在線引物設計網站
1、 Primer3
http://bioinfo.ut.ee/primer3/
一個廣泛使用的PCR引物設計程序。
2、Primer-BLAST
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/
在線設計用於聚合酶鏈反應（PCR）的特異性寡核苷酸引物,這個工具同時整合了Primer3和NCBI的Blast功能。
3、GeneFisher
http://bibiserv.techfak.uni-bielefeld.de/genefisher2/
提供一個在線的簡併引物設計工具，基礎是同源基因。
4、Primer3Plus
http://www.bioinformatics.nl/cgi-bin/primer3plus/primer3plus.cgi
5、BiSearch
http://bisearch.enzim.hu/?m=genompsearch
特別推薦設計用於擴增高度冗餘的亞硫酸氫鹽處理的序列的引物。提供快速的ePCR方法避免非特異性PCR產物。
6、Web Primer
https://www.yeastgenome.org/cgi-bin/web-primer
史丹福大學提供的在線引物設計軟體,酵母基因組資料庫提供。
7、AutoPrime
http://www.autoprime.de/AutoPrimeWeb
快速設計真核表達實時定量PCR引物在線軟體。
下面就Primer-BLAST的用法做一下介紹
進入NCBI的Primer-BLAST，
1、Primer-BLAST的輸入
Primer-BLAST界面包括了Primer3和BLAST的功能。提交的界面主要包括三個部分：target template（模板區）, the primers（引物區）, 和specificity check（特異性驗證區）。
如下圖，在「PCR Template」下方左側的文本框中輸入FASTA格式的序列或Accession Number，或點擊「選擇文件」載入FASTA格式的文件。右側可以設置正向引物和反向引物的起始和終止位置。在「Primer Parameters」模塊，可以輸入PCR產物的大小和Tm值參數。如何你已經設計好了引物，要拿來驗證引物的好壞，可以在此輸入。
2、驗證引物的特異性
在「Primer Pair Specificity Checking Parameters」區，選擇設計引物或驗證引物時的目標資料庫和物種。這一步是比較重要的。這裡提供了7種資料庫：RefSeq mRNA, Refseq representativegenomes，nr，RefseqRNA(refseq_rna)，Genome (reference assembly fromselected organisms), Custom, and Genome(chromosomes from all organisms)。推薦使用「Refseq representative genomes」資料庫；Genomedatabase (chromosomes from all organisms)是NCBI染色體資料庫的舊版本，不再推薦使用；Custom可以使用自己的序列作為搜索資料庫。當你用NCBI的參考序列作為模板和參考序列資料庫
作為標準來設計引物時，Primer-BLAST可以設計出只擴增某一特定剪接變異體基因的特異引物。跟其它的BLAST一樣，點擊底部的「Advanced parameters」有更多的參數設置。
3、結果界面
上圖是引物的可視化結果，該結果會顯示出所有引物的起始和終止位置，基因的CDS區，外顯子的位置等。
其次，Primer-BLAST還會給出每一個引物對的具體信息，如下圖。包括引物序列，長度，起始終止位置，Tm值，GC含量，自身互補和3』端互補情況，PCR產物的長度和位置等。其中，Self complementarity和Self 3' complementarity的值越小越好。
如需primer5.0 軟體請後臺回復「primer5」
來源：生信人