PCR技術應用之一---基因定點突變的原理

2021-02-08 生物頌

闡明生命現象的規律，必須建立在闡明生物大分子結構的基礎上。                                                —中國科學院院士鄒承魯

 PCR技術是一項很強大的技術手段，當然也是考試的重點了。今天重點說一下PCR技術應用之一：OverlapPCR技術---基因定點突變


1. 基因定點突變：將某基因中的一個或者幾個鹼基替換（補充說明也可以增加或者缺失鹼基對）成其它鹼基，導致基因中的部分鹼基序列發生改變（也就是我們說的遺傳信息發生改變），實現基因的定點突變。  通過上圖可以發現，只要設計出DNA上某一段片段（本圖也就是藍色的目的基因片段）兩側的一對方向相反的引物，那麼這一對引物，所夾的那段（本圖就是目的基因）經過至少三輪的DNA複製（擴增）就會得到中間的那段目的基因。3.應用OverlapPCR技術：如下圖,採用具有互補末端的引物(b與c兩個引物互補），使PCR的產物形成一段重疊鏈，然後通過重疊部分的延伸，將來源不同的擴增片段重疊拼接的技術。4.使用OverlapPCR技術使基因的定點突變。（1）首先在需要突變的位點設計一個突變的引物對，這對引物對於基因來說位於中央位置，如上圖的Fm和Rm，帶紅色標記的是替換成別的鹼基，比如正常是C可以換成T等方法，當然Fm和Rm位於突變區域的相同位置而且需要反向互補，能夠進行鹼基互補配對。同時還應設計他們對應的引物，也就是基因兩端的，像上圖的F和R引物。（2）設計好上述的引物：第一輪PCR---分別R和Fm，F和Rm為引物對擴增(也可以分兩次做PCR），根據我上面說的PCR的結論就可以得到左右兩部分的DNA片段，關鍵會出現相同也就是一樣的一段---突變位點那部分；（3）擴增完成後的產物同時為模板進行下一輪的PCR，因為突變位點倆區域可以鹼基互補配對而連接起來，這樣可以將來源不同的擴增片段重疊拼接起來，然後引物的作用下延伸，最後在引物R和F擴增出大量的突變基因。這樣可能還是有點模糊和疑問。4.為此生物頌100的小崔老師專門找到了北京市海澱區（2018年期中）考過一個相關的的題，可以應用一下。練習.（2018海澱期中，34）蘿蔔的蛋白A具有廣泛的抗植物病菌作用，而且對人體沒有影響。我國科學家欲獲得高效表達蛋白A的轉基因大腸桿菌作為微生物農藥，做了相關研究。（1）研究者用相同的_________酶處理蛋白A基因和pET質粒，得到重組質粒，再將重組質粒置於經_________處理的大腸桿菌細胞懸液中，獲得轉基因大腸桿菌。（2）檢測發現，轉入的蛋白A基因在大腸桿菌細胞中表達效率很低，研究者推測不同生物對密碼子具有不同的偏好，因而設計了與蛋白A基因結合的兩對引物（引物B和C中都替換了一個鹼基），並按圖2方式依次進行4次PCR擴增，以得到新的蛋白A基因。②圖2所示的4次PCR應該分別如何選擇圖1中所示的引物？請填寫以下表格（若選用該引物劃「√」，若不選用該引物則劃「×」）。
















（3）研究者進一步將含有新蛋白A基因的重組質粒和_________分別導入大腸桿菌，提取培養液中的蛋白質，用_________方法檢測並比較三組受體菌蛋白A的表達產物，判斷新蛋白A基因表達效率是否提高。為檢測表達產物的生物活性，研究者將上述各組表達產物加入到長滿了植物病菌的培養基上，培養一段時間後，比較_________的大小，以確定表達產物的生物活性大小。（4）作為微生物農藥，使用時常噴灑蛋白A基因的發酵產物而不是轉蛋白A基因的大腸桿菌，其優點是_________。②如下表所示。註：正確填寫PCR1、PCR2、PCR3、PCR4的引物組合之一，每填對一個得1分。共4分。
（3）含有蛋白A基因的重組質粒、空質粒（pET質粒）  抗原-抗體雜交   抑菌圈（4）對人、畜、農作物和自然環境安全；不會造成基因汙染；有效成分純度較高。（答對一點或其他合理答案均可得分）通過這道題，你對PCR定點突變的應用應該有了更深一層的認識，如果還是有疑問可以查閱相關資料或者加我微信18310709058我們一起探討一下。PCR技術還有很多應用：如檢測基因型，分子克隆，基因敲除等，被廣泛應用於基礎研究、疾病診斷、農業檢測和法醫調查等領域。

備註：小編能力有限，如有不足之處，希望批評指正，信息僅供參考學習。

參考資料：

1.黃立華，梁山，谷峻等著 。《分子生物學實驗技術》，科學出版社。

2.http://pic.sogou.com/pics?query=pcr%B6%A8%B5%E3%CD%BB%B1%E4%CA%BE%D2%E2%CD%BC&p=40230500&st=255&mode=255&policyType=0；

3.https://baike.sogou.com/v483259.htm?fromTitle=%E5%AE%9A%E7%82%B9%E7%AA%81%E5%8F%98

　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　崔老師整理2020.1.8 


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