歷時多月，我們終於從疫情的陰霾下走出，逐步恢復生產生活，各位老師的科研也到了驗證成果的關鍵時刻。上周，我們介紹了全轉錄組後期驗證——mRNA篇，本周，我們繼續為大家介紹非編碼RNA驗證篇，包括miRNA、lncRNA和circRNA三類非編碼RNA。我們將按照實驗的邏輯順序，對三類RNA分別從表達水平驗證、功能驗證以及lncRNA基因定位驗證幾部分剖析本次內容。接下來讓我們拿出小本本，趕快開始學習吧!
一、首先，我們先來了解一下非編碼RNA中舉足輕重的一個角色-miRNA。
miRNAs是一類長約20nt~32nt的單鏈小RNA，miRNA的功能主要是沉默靶基因表達：在RISC沉默複合體協助下，miRNA與其靶基因mRNA的3'-UTR（3'端的非翻譯區）結合，抑制轉錄或誘導mRNA降解。
我們拿到miRNA測序數據後，做的第一部實驗驗證往往是根據其表達量水平對測序數據進行驗證，會用到RT-qPCR，利用篩選到的差異miRNA表達量與測序數據相關性分析判斷測序數據的可靠性。
1.表達驗證：qPCR
對於miRNA的實時螢光定量驗證方法一般分兩種：頸環法和加尾法。
（1）頸環法：
原理：由於miRNA在20bp左右，沒法根據其設計引物檢測出來，於是，人們就先將其延長，也就是先加一個環狀片段，這樣就使得原來20bp左右的延伸為80bp左右，然後就可以根據這個80bp片段設計引物。
需要三種引物：逆轉錄引物（RT-primer，用於延長miRNA的）、實時定量PCR上遊引物、實時定量PCR通用下遊引物
上遊引物：包括5』端通用序列和3』端miRNA特異序列
下遊通用引物：莖環引物上取，合適即可
頸環法示意圖
（2）加尾法
原理：加尾反轉錄法利用poly(A)聚合酶為成熟的miRNA加上poly(A)尾巴，然後用5』端帶通用標籤的Oligo-dT作為反轉錄引物，獲得人為加長的miRNA cDNA第1鏈，最後用與通用標籤序列互補的反向引物進行染料法或者探針法的螢光定量PCR檢測。這種方法可以批量地將所有成熟miRNA加上poly(A)尾巴，然後進行反轉錄和檢測。
加尾法示意圖
（3）頸環法和加尾法的主要區別：
頸環法只針對成熟miRNA，特異性相對較高，但操作繁瑣，成本較高；
加尾法可以檢測到成熟miRNA及pre-miRNA，特異性稍低，但操作及引物設計簡單
2.功能驗證：
在我們分析步驟通過對miRNA進行靶基因預測和功能注釋分析後，找到其潛在的靶基因及可能行使的功能後，要對其進行功能實驗驗證；通過將miRNA模擬物轉染入細胞中檢測其表達量及其靶基因的表達量關係，結合表型觀察（免疫螢光染色）等方法對實驗進行功能驗證。
細胞轉染：
（1）脂質體轉染法：陽離子脂質體表面帶正電荷，能與核酸的磷酸根通過靜電作用，將DNA分子包裹入內，形成DNA脂複合物，也能被表面帶負電的細胞膜吸附，再通過融合或細胞內吞進入細胞。脂質體轉染適用於把DNA轉染入懸浮或貼壁培養細胞中，是目前實驗室最方便的轉染方法之一，其轉染率較高，優於磷酸鈣法。由於脂質體對細胞有一定的毒性，所以轉染時間一般不超過24小時。常用細胞類型：cos-7、BHK、NIH3T3 、Hela等。
（2）病毒轉染：
對於脂質體轉染與電穿孔轉染都無法成功轉染的細胞系建議用病毒感染，此法可以快速100%感染，檢測成功率高。
3.靶標驗證：
對miRNA及其預測到的靶基因是否具有靶標關係和結合情況，常用實驗方法有以下幾種：
（1）雙螢光素酶報告系統
作用原理：在報告基因如螢光素酶CDS的下遊3』-UTR區域插入待確認的目的序列，如果3』UTR過長或引物設計困難，可以選取包括miRNA結合位點的一段3』UTR，再用miRNA進行處理（過表達），如果目的基因上含有靶位點，則螢光素酶的轉錄受到抑制不發螢光。
（2）通過人工合成miRNA模擬物(miRNA mimics)或miRNA抑制物(miRNA inhibitor)，增強或抑制miRNA的抑制效果，並與對照相比，檢測目的序列的表達變化。
雙螢光素酶報告系統示意圖
文獻示例：
1.作者首先對差異mRNA和miRNA分別作了統計和篩選，然後通過RT-qPCR對6個感興趣的差異miRN進行驗證：
2.之後作者分別將mRNA和miRNA的數據進行分析和篩選，對miRNA-mRNA作用對進行統計，找到與免疫相關的重要基因轉穀氨醯胺酶2（TGM2）。
作者首先確定了miRNA和mRNA的靶標結合情況，並通過qPCR確定兩者的逆表達情況。
3. 之後，使用RT-qPCR定量檢測用gga-miR-203a模擬物或抑制劑處理後，DF-1細胞中TGM2的表達。與陰性對照相比，過度表達或幹擾，發現用gga-miR-203a可以顯著抑制TGM2的表達（圖5C）
螢光素酶測定證實了gga-miR-203a和TGM2之間的反比關係（圖5D）
4.最後，在生物學功能驗證中，用gga-miR-203a模擬物或rAd-miR-203處理的DF-1細胞和雞胚中的NDV增殖檢測。如圖5E，F所示，gga-miR-203a的過量表達，胚胎死亡和NDV感染顯著加快。相反，TGM2的過表達明顯抑制mRNA水平或病毒粒子水平的NDV複製（圖5G，H）。因此確定，gga-miR-203a調節TGM2的表達，其在NDV感染中起負面作用。
二、接下來我們來看一下本篇分享的第二部分內容：非編碼RNA中另一重要角色-「lncRNA」
1. lncRNA的後期功能驗證，其主要方法如下：
RNAi 幹擾、EST、VIGS、原位雜交、過表達共分析；
選擇一個感興趣的信號通路，選擇關鍵蛋白，進行WB 驗證
功能獲得性研究：構建 lncRNA 過表達載體：原則上是將全長 lncRNA 定向克隆到表達載體上實現lncRNA的過表達。然而有些 lncRNA 很大或全長尚未分離，這時將視lncRNA在基因組上的定位採取不同的研究策略。
功能缺失性研究：可通過 siRNA、 shRNA、反義核酸等方法沉默lncRNA，幹預 lncRNA 後檢測其對疾病相關基因表達的影響和對細胞表型如增值、凋亡、侵襲、轉移等的影響採用RNA pull down 、RNA-RIP(RNA Binding Protein Immunoprecipitation) 、ChIRP-seq(Chromatin Isolation by RNA Purification)等方法檢測與 lncRNA 結合 的DNA、RNA、蛋白質。
2. lncRNA的後期表達量水平驗證：
目的：驗證測序數據，驗證lncRNA表達量水平變化
與miRNA類似，首先利用RT-qPCR對lncRNA測序數據進行驗證。
qPCR驗證-線性RNA
Northernblot：對lncRNA表達豐度和序列信息進行驗證
Westernblot：對蛋白進行定性定量分析
3.基因定位驗證：
目的：lncRNA定位分為細胞核定位和細胞質定位兩種，驗證lncRNA細胞定位與lncRNA的調控機制和功能相關。常用實驗方法包括亞細胞定位和原位雜交。
（1）亞細胞定位：指某種蛋白或表達產物在細胞內的具體存在部位，例如在核內、胞質內或者細胞膜上存在。越來越多的證據顯示，在生物學過程中位於不同的亞細胞器RNA擁有不同的功能，亞細胞定位有利於更深入地了解RNA的生物功能。
2016-Plant cell-擬南芥-RNA-seq-擬南芥硝酸鹽代謝NRG2 NRT1.1、NLP7的相互作用機制
（2）原位雜交：將已標記的RNA探針（可在探針上標記螢光基團、生物素、地高辛等）與組織切片或細胞中的待測RNA中的互補序列雜交，從而對組織細胞中的RNA進行定性、定位和相對定量分析。
Genome-wide screening and functional analysis identify a large number of long noncoding RNAs involved in the sexual reproduction of rice
基因功能驗證及其示例：
（1）基因敲除：
目的：令特定的基因功能喪失作用，從而使部分功能被屏蔽，並可進一步對生物體造成影響，進而推測出該基因的生物學功能。
基因敲除示意圖
（2）過表達:
構建 lncRNA 過表達載體：原則上是將全長 lncRNA 定向克隆到表達載體上實現lncRNA的過表達。
過表達lncRNA促進細胞增殖
三、最後讓我們來了解一下本篇分享的第三部分內容：非編碼RNA中一顆「新星」-「circRNA」
1.表達量水平驗證：
線性RNA是根據目的片段的上下遊分別設計引物，稱之為convergent primer，擴增出來的片段就位於上下遊引物之間。
circRNA基於它的成環機制，除backsplice junction位點處不同於線性RNA之外，其他區域跟線性RNA基本都一致。
circRNA驗證時需針對backsplice junction位點處特異性設計引物，稱之為divergent primer。
其他設計上的注意事項與常規PCR引物設計相同。
此外，對於內含子環化的circRNA，除在backsplice junction位點處設計引物之外，還可以根據內含子區域設計引物。
CircRNA引物設計示意圖
2.功能水平驗證：
（1）circRNA功能獲得：
側翼反向互補序列誘導目前較為普遍的做法，基於circRNA的形成機制，側翼序列鹼基互補配對——Alu結構介導的非線性剪接成環。基於此，PCR擴增circRNA外顯子序列，包括側翼Alu序列連接至表達載體中。定量PCR檢測轉染效率。然後用divergent primer驗證circRNA過表達倍數
注意事項：
擴增目的區域包含circRNA側翼Alu序列或內部鹼基互補序列，擴增的側翼上下遊序列長度為1kb時表達效率較好；
目的區域擴增時選用的是基因組DNA為模版。
（2）circRNA功能缺失：
siRNA幹擾：
針對circRNA backsplice junction位點區域序列設計siRNA對於內含子環化circRNA，也可針對內含子區域設計相應siRNA用Divergent primer驗證circRNA敲降倍數-敲降效率。
注意事項：
設計siRNA時也需設計相應的對照，即backsplice junction位點一端序列互補配對，另一端則錯配。
本篇文章分別對miRNA、lncRNA和circRNA從表達量驗證，功能驗證到靶標和定位驗證相關實驗做了系統性的闡述和注意事項提醒，看到這裡的您是否對全轉錄組後期驗證有了更多的啟發呢，那還等什麼呢，根據您的想法結合本篇文章去展開設計您的驗證實驗吧！
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參考文獻：
[1] Yan-Qing J , Xing-Long W , Xiang-Wei W , et al. Common microRNA–mRNA Interactions in Different Newcastle Disease Virus-Infected Chicken Embryonic Visceral Tissues[J]. International Journal of Molecular Sciences, 2018, 19(5):1291-.
[2] Xu N , Wang R , Zhao L , et al. The Arabidopsis NRG2 Protein Mediates Nitrate Signaling and Interacts with and Regulates Key Nitrate Regulators[J]. Plant Cell, 2016, 28(2):TPC2015-00567-RA.