基因編輯動物的明星無角牛遇到了麻煩。
圖 | 基因編輯而來的無角牛（來源：麻省理工科技評論）
美國 FDA 的科學家研究了 Recombinetics 公司經由基因編輯得到的一頭無角牛發現，這頭名為 Buri 的公牛體內存在一段細菌 DNA，是具有抗生素抗性的基因片段。FDA 稱，這是一段在基因編輯過程中無意添加進去的基因片段。
此前，該公司宣稱這頭牛是百分百的牛，並指責 FDA 不應該對這類動物進行監管。
據《麻省理工科技評論》報導，Recombinetics 子公司 Acceligen 的執行長 Tad Sontesgard 表示，這個是無意的非預期結果，公司應該做一個完整的檢查。
此次質粒汙染事件，可能讓 Recombinetics 這家明星創業公司陷入大麻煩，但對於基因編輯產業的健康發展是個良性的提醒。
質粒 DNA 汙染的發現
這是基因編輯操作過程導致的 DNA 汙染。
7 月 28 日，美國 FDA 的科學家 Alexis L. Norris 和 Stella S. Lee 在預印本 bioRxiv 發表題為《在基因組編輯種系牛中發現質粒模板》一文。研究人員分析了來自該牛的全基因組測序數據，在靶位點發現了質粒和第二個修復模板 DNA 序列的雜交整合。
FDA 研究人員發現，兩頭基因編輯牛中都存在全長的質粒骨架。在兩頭牛中，雖然一個等位基因產生了預期的編輯結果，但另一個等位基因的靶位點處發現質粒與修復模板序列的重組。
圖 | 修復模板和質粒整合在牛基因編輯的靶位點。圖 a 為模板質粒，圖 b 為未經編輯的親本細胞系，圖 c 為編輯過的牛基因結構。（來源：bioRxiv）
論文稱，此前科學研究發現過哺乳動物基因編輯實驗中靶點處出現了複雜的基因組重排現象，而這種現象通過常規的 PCR 和 DNA 測序方法難以檢測出來。
Recombinetics 公司於 2013 年使用了質粒進行基因編輯操作，即將攜帶基因編輯工具 TALENs 和涉及無角的基因變異的質粒植入細胞，編輯後的細胞用於克隆，之後就產生了兩頭無角牛 Buri 和 Spotigy。
具體而言，通過 TALENs，以無角安格斯牛 1 號染色體上重複 212 鹼基對替代了原來細胞染色體上 10 個鹼基對的重複序列，得到了經基因編輯的荷斯坦牛胎兒成纖維細胞。隨後通過體細胞核移植技術成功獲得了基因編輯無角荷斯坦奶牛。通過檢測，這些基因編輯牛都無角，且不存在其他症狀。
這兩頭牛於 2015 年出生，一時間成為各大國際媒體報導的寵兒。Spotigy 被殺死以分析其組織，Buri 則繁衍了 17 個後代。
儘管相比目前的其他育種技術，基因編輯技術更為精確，但一直以來，有對基因編輯可預測性和可靠性的擔心。Recombinetics 公司一直宣稱，他們確切知道基因應該去哪裡以及其所在的位置，並擁有基因編輯沒有脫靶的證據。與此同時，該公司認為 FDA 對基因編輯動物產品以新藥開發的模式進行監管不合理，因此一直呼籲 FDA 豁免其基因編輯產品的監管。
如今科學家認識到，基因編輯可能產生錯誤。即使是其他基因編輯技術，如鋅指核酸酶（ZFN）技術也已經發現模板質粒整合事件在靶位點和非靶位點都有發生，還有研究發現，CRISPR/Cas9 編輯的秀麗線蟲靶位點處發現模板質粒的整合。
FDA 負責動物生物工程的 Heather Lombardi 表示，當研究人員使用基因編輯技術製造 DNA 斷裂時，細胞會啟動自我修復機制，理想狀態下，它會正確修復，但實際上細胞可以整合任何靶點附近的 DNA。
汙染的風險有多大
質粒 DNA 汙染意味著什麼呢？根據轉基因生物產品的定義，只要產品中出現質粒 DNA，那麼就意味著這種產品應該被視作轉基因產品。
那麼在 Buri 的 17 個後代中，差不多一半的牛體內會含有這種質粒 DNA。
含有質粒 DNA 的牛肉能吃嗎？Tad Sontesgard 認為，無論有沒有質粒，這些牛的肉都是可以食用的。加州大學戴維斯分校獸醫科學家 Alison Van Eenennaam 也說，這種無角牛即使有質粒 DNA 汙染，也不必擔心食品安全問題。
事實上，科學共識也是這麼說的，吃了轉基因食品並不會轉變進食者的基因與健康狀況。《麻省理工科技評論》則指出，需要關心的是，牛體內的細菌會不會受到這些抗生素抗性基因的影響，以及這些基因會不會散播出去。
Tad Sonstegard 承認，Acceligen 公司沒有提早發現質粒在無角牛體內的存在，但承諾現在會專門設置此篩查程序。
據美國非營利機構「新食品經濟」（New Food Economy）報導引述 Heather Lombardi 的看法稱，基因編輯技術是一種新興的技術，仍處於改進完善的進程中，它很可能會額外產生非預期且不易察覺的錯誤。雖然這些錯誤可能不會帶來額外的風險或安全問題，但人們需要盯緊以儘量避免。
無角牛前路不樂觀
此前的媒體報導中，Recombinetics 公司無角牛代表著人道主義。
牛角本來是用來禦敵的，但在如今的農場裡，牛角就失去了歷史上的作用。相反，牛角常常會對其他牛或養殖工人造成傷害，於是農場主都會給幼牛進行去角處理，大都是直接削去幼牛頭上的嫩角，然後灼燒止血。可以想像，幼牛的痛苦是非人道的，另外這種處理的成本也很高。所以，如果能培育一種無角牛，對農場主和普通民眾都是眾望所歸。
科學家發現，某些天然無角品種的牛是因為兩個基因中的任意一個發生了突變，即凱爾特牛的 Pc 基因和荷斯坦牛的 PF 基因。而常規育種來實現無角牛所花費的成本太高，加上奶牛需要綜合最大產奶潛力、健康、體格穩健以及可育性等多種因素，如果想通過選擇育種得到無角奶牛，就需要用很多代雜交過程來實現，這是養殖者無法負擔的。
基因編輯技術正是科學家相中的最得力工具。在 Recombinetics 得到 Buri 和 Spotigy 後，按照育種程序就該選育出優良的基因編輯公牛品種，通過常規雜交將 Pc 等位基因傳播到全球。
2016 年，明尼蘇達州聖保羅市的 Recombinetics 向 FDA 提出申請，希望得到無角牛的監管豁免。該公司稱無角牛是一種自然出現的突變，而無角牛僅僅利用基因編輯技術關閉了其中一個基因。但 FDA 拒絕了這項申請。
於是 Recombinetics 決定尋找美國之外的市場，他們獲得了巴西監管機構的「綠燈」。只是這次質粒汙染事件對於 Recombinetics 公司的無角牛是嚴重打擊，意味著相關研究告一段落，其前途陷入渺茫。同時，巴西監管機構宣布，拒絕該公司相關產品的申請。
專訪中科院遺傳與發育研究所高級工程師姜韜：不必誇大質粒汙染的影響
DeepTech：FDA 研究人員分析了來自該牛的全基因組測序數據，在靶位點發現了質粒和第二個修復模板 DNA 序列的雜交整合。那麼這種非預期結果在基因編輯過程中出現頻繁嗎？以及可能有哪些原因導致這樣的結果呢？
姜韜：我們知道，基因編輯過程中必然有 DNA 切斷的過程，然後利用細胞自身的重組機制連接起來，確保染色體的完整性，以在細胞分裂時遺傳給子代細胞。
細胞自主的重組過程有一定的不可控性，就是有可能將染色體斷裂部位附近的 DNA 分子隨機連接起來整合到染色體中。如果在基因編輯時，存在線性化的質粒 DNA，那就難免這些質粒 DNA 也會被連接起來重組到基因組中。
之所以會有這個問題，是因為對進行基因編輯的細胞進行遺傳轉化時，往往需要帶入表達基因載體——利用細胞本身來表達基因組編輯必需的工具酶，也就是質粒。這個現象是有一定概率發生的，好在事後可以清楚地鑑定出來，甚至淘汰掉這種個體。
DeepTech：論文說，常規檢測難以發現這樣的質粒整合，這是說常規 PCR 檢測存在漏洞嗎？為何這個漏洞之前沒有被重視？
姜韜：原文這個說法站不住腳，質粒 DNA 序列是完全清楚的，非常容易通過常規 PCR 檢測出來，除非是研發者沒有做這個檢測。
DeepTech：如果要預防這樣的結果出現，目前有哪些解決方案嗎？
姜韜：即使發生了質粒整合，很容易檢測出來，事後處理也很簡單。目前用於大腸桿菌基因編輯的商業試劑盒，早就有消除質粒技術了。至於是否會一開始就能徹底避免，需要基因編輯的研發者們攻關了。
如今已經有的瞬時表達技術，在質粒表達完核酸酶之後，質粒 DNA 被迅速降解，那麼也就沒有機會整合到細胞基因組，甚至還可以通過基因槍直接將在體外組裝的核糖核蛋白複合體輸送到細胞中進行編輯。只有直接注射進現成蛋白質酶分子，而不用藉助細胞來表達工具酶的，才可以徹底避免質粒 DNA 的插入。
DeepTech：植物的基因編輯會不會遇到類似的問題？
姜韜：只要是轉化基因編輯的細胞，要利用這個細胞做宿主來表達外源基因，就有一定概率發生非同源重組，整合進非預期的質粒 DNA。這與編輯的基因是微生物或者動植物都沒有關係。
DeepTech：如何看待 Recombinetics 公司這次遇到的麻煩，以及這個事件可能帶給基因編輯應用發展的影響？還有，這個事件會給基因編輯在各國的監管帶來怎樣的影響？
姜韜：鑑於上面理由，我認為對基因編輯產業不會有什麼影響。只需要認真做好事後檢測和處理就可以了。當然，監管部門可以強制基因編輯生物製造單位做這種檢測和處理，以避免在分子水平上產生非預期的生物體。