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來自日本東京大學的Makoto Nishiyama課題組在2018年發表關於具有獨特腙單元的二肽天然產物S56-p1的生物合成中肼形成機制的文章。並發現這種機制組成的基因廣泛存在於多個個細菌門，揭示了細菌具有合成肼類化合物的無限潛力。
含有氮-氮（N-N）鍵的天然產物結構多樣，具有不同的生物活性。從放線菌中鑑定出含有重氮、氮氧、醯肼、肼、腙、吡嗪基團的天然產物的生物合成基因簇越來越多。對這些基因簇的研究表明，自然界利用幾種不同的策略形成N-N鍵；然而，在大多數情況下，負責N-N鍵形成的機制尚未詳細闡明。
S56-p1（1）是從鏈黴菌中發現具有獨特腙單元的二肽化合物。採用氨基載體蛋白基因的基因組挖掘方法確定其生物合成基因簇，是第一個被確定負責含腙的天然產物的生物合成的基因簇（圖1a）。
作者將含有spb37-spb50的基因片段導入到異源宿主Streptomyces lividans TK23中，在培養液的酸水解物中檢測到N2H4。通過基因敲除確定了該化合物生物合成所需的基因為N-羥化酶的spb38和由Cupin和methionyl-trna合成酶（metrs）樣蛋白組成的融合蛋白spb40。然後，作者研究了spb40的功能，將spb40與spb38一起在大腸桿菌中表達。對重組大腸桿菌細胞代謝產物進行LC-MS分析，能夠檢測到化合物1（圖1b），而在缺乏spb38或spb40的大腸桿菌細胞培養液中未檢測到。
由Spb40催化形成N-N鍵的機制有兩種：一種是分子間形成N-N鍵，由L-賴氨酸N6處的羥胺基團被磷酸化或腺苷化激活，甘氨酸氨基發生親核攻擊（圖2a）。另一種機制是通過N6-OH-L-賴氨酸和甘氨酸形成酯中間體（圖2b）。為了確定是哪種途徑，作者進行在N6-18OH-L-賴氨酸的投餵實驗。對所得培養液LC-MS分析化合物1中可檢測到18O原子（圖2c）。此外，MS-MS分析表明，18O是結合到1的甘氨酸分子的羧基中（圖2d，e）。這一結果表明，Spb40通過圖2b的途徑合成了1，其中N-N鍵是通過假定的酯中間體重排形成的。
Spb39與d-胺基酸氧化酶同源，後者催化Cα-N鍵氧化，以FAD依賴的方式生成亞胺基團，氧化後水解亞胺酸以提供α-酮酸和氨。將重組spb39加入生產1的大腸桿菌過濾培養液中，與0.1mM FAD一起孵育，用DNFB衍生反應產物。連續的lc-ms分析表明，消耗了化合物1（m/z522.1321），並產生了一個新的化合物（m/z257.0513），其分子式為C8H9N4O6（圖3a，b）。這表明C6-N鍵被spb39氧化。這些結果表明，spb39以FAD依賴的方式氧化1產生HAA和AASA。
HAA生物合成途徑如圖3c所示，是首次被證實。然而，一項爆炸性的研究表明，類似的基因簇不僅廣泛分布在放線菌中，而且廣泛分布在來自幾個不同門的各種細菌物種中：蛋白質細菌、硬細菌、去球菌和藍藻。這一結果與放線菌是含N-N鍵天然產物的主要細菌來源形成鮮明對比。在某些情況下，HAA生物合成的基因簇與可能參與次生代謝物生物合成的基因共定位，如非核糖體肽合成酶，表明HAA也被用作菌株中未識別的天然產物的共同中間體。因此，本文揭示了細菌具有合成肼化合物的潛力，未來會通過基因挖掘方法發現HAA衍生的新的天然產物。
https://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/jacs.8b05354