【實驗目的】
（1）學習乳酸發酵和製作乳酸菌飲料的方法。
（2）了解乳酸菌的生長特性。
【實驗原理】微生物在厭氧條件下分解己糖產生乳酸的作用，稱為乳酸發酵。能發酵糖產生乳酸的細菌通稱為乳酸細菌。常見的乳酸細菌屬於鏈球菌屬（Streptococcus）、乳桿菌屬（Lactobacillus）、雙歧桿菌屬（Bifidobacterium）和明串珠菌屬（Leuconostoc）等。乳酸細菌發酵產生的乳酸和厭氧生活的環境，能夠抑制一些腐敗細菌的活動，故可利用乳酸發酵製造青貯飼料及日常生活中醃製泡菜等。乳酸細菌多是耐氧菌，在厭氧條件下進行乳酸發酵，所以在篩選乳酸菌或需要進行乳酸發酵的情況下，應保證提供厭氧條件。酸奶是以全脂牛奶等為原料，經乳酸細菌發酵而成的一種具有較高營養價值和特殊風味的發酵製品，是具有一定保健作用的食品。製作酸奶的基本原理是通過乳酸細菌發酵牛奶中的乳糖產生乳酸，乳酸使牛奶中的酪蛋白變性凝固而使整個奶液呈凝乳狀態。同時，通過發酵還可以形成酸奶特有的風味和香味。按凝固狀態不同，酸奶分為攪拌型酸奶和凝固型酸奶，兩者工藝過程基本相似。本實驗主要學習凝固型酸奶的製作方法。
【實驗器材】
1．菌種嗜熱乳酸鏈球菌（Streptococcus thermophilus）、保加利亞乳酸桿菌（Lactobacillus bulgaricus），也可以從市場銷售的各種新鮮酸奶或酸奶飲料中得到菌種。
2．培養基MRS瓊脂培養基、馬鈴薯牛奶瓊脂培養基。
3．儀器和用具恆溫水溶鍋、酸度計、高壓蒸汽滅菌鍋、超淨工作檯、培養箱等。
4．其他材料脫脂乳粉或全脂乳粉、鮮牛奶、蔗糖、碳酸鈣。
【實驗步驟】
1．乳酸菌的分離
（1）倒平板：將MRS瓊脂培養基和馬鈴薯牛奶瓊脂培養基加熱融化，冷卻至45℃左右，分別各倒3個平板。
（2）樣品稀釋：取市售新鮮酸奶稀釋至10-5。
（3）平板分離：取其中的10-4、10-5兩個稀釋度的稀釋液各0.1mL，分別接入培養基平板上，用無菌塗棒依次塗布（或者直接用接種環沾取原液平板劃線分離）。
（4）恆溫培養：將培養皿置於37℃恆溫箱中培養48h，也可放入厭氧罐中培養。
（5）菌落鑑別：在馬鈴薯牛奶瓊脂培養基上，如出現圓形稍扁平的淡黃色菌落，或菌落周圍出現水解透明圈者，可初步定為乳酸菌。
（6）形態觀察：選取乳酸菌典型菌落，接入消毒牛奶試管中，40℃培養8～24h，若牛乳出現凝固，無氣泡，呈酸性，鏡檢細胞呈杆狀或鏈球狀（兩種形狀的菌種均分別選入），革蘭氏染色呈陽性，則可將其連續傳代4～6次，作為菌種待用。
2．乳酸發酵及檢測
（1）發酵：按無菌操作將分離的乳酸菌株接種於裝有300mL乳酸菌培養基的三角燒瓶中，於40～42℃靜止培養。為了便於測定乳酸發酵情況，實驗分2組。一組在接種培養後，每6～8h取樣分析，測定pH值；另一組在接種培養24h後每瓶中加入CaCO3（以防止發酵液過酸，使菌種死亡）3g，每6～8h取樣分析。
（2）定性檢測：取上述培養液約10mL於試管中，加入10％H2SO41mL，再加2％KMnO41mL，此時乳酸轉化為乙醛。把事先在含氨的硝酸銀溶液中浸泡的濾紙條搭在試管口上，微火加熱試管至沸，若濾紙片變黑，則說明有乳酸存在。
3．乳酸菌飲料的製作
（1）培養基：將奶粉和水以1∶（7～10）（m/V）的比例配成還原奶，同時加入5％蔗糖，充分混合，於85～90℃消毒15min，然後冷卻至35～40℃，作為製作飲料的培養基質。
（2）接種：分別以純種嗜熱乳酸鏈球菌、純種保加利亞乳酸桿菌及兩種菌的等量混合菌液作為發酵劑，以體積分數為2％～5％的接種量接入以上培養基質中。接種後搖勻，分裝到已滅菌的牛奶瓶中，隨後將瓶蓋擰緊密封。亦可按5％～10％（V/V）比例將市售新鮮酸奶為發酵劑進行接種。
（3）培養：把接種後的酸奶瓶置於40～42℃恆溫箱中培養3～4h。培養時注意觀察，在出現凝乳後停止培養。然後轉入4℃的低溫下冷藏24h以上。經此後熟階段，達到酸奶酸度適中（pH4～4.5），凝塊均勻緻密，無乳清析出，無氣泡，獲得較好的口感和特有風味。
（4）品嘗：通過品嘗評定酸奶質量，比較單菌株發酵和混合菌株發酵的酸奶質量，主要包括香味和口感。若出現異味，表明酸奶汙染了雜菌。
【實驗報告】
1．實驗結果
（1）描述MRS瓊脂培養基上乳酸菌的菌落特徵和鏡檢細胞特徵。
（2）將發酵的酸奶品評結果記錄於下表中。
表12-1 乳酸菌單菌及混合菌發酵的酸奶品評結果
2．思考題
（1）發酵酸奶為什麼能引起凝乳？
（2）為什麼採用乳酸菌混合發酵的酸奶比單菌發酵的酸奶口感和風味更佳？
（3）試設計從市售泡菜中分離純化乳酸菌及泡菜製作的實驗方案。
（董新嬌）