一、實驗目的
學習從植物材料中分離過氧化物酶同工酶的方法和技術；
掌握鑑定小麥幼苗過氧化物酶同工酶的方法和原理；
複習聚丙烯醯胺凝膠垂直板電泳的原理和操作技術。
同工酶是催化同一種化學反應，但其酶蛋白本身的分子結構組成卻有所不同的一組酶。同工酶與生物的遺傳、生長發育、代謝調節及抗性等都有一定關係，測定同工酶在理論上和實踐上都具有重要的意義。本實驗測定的過氧化物酶是植物體內普遍存在的、活性較高的一種酶，它與植物的光合、呼吸作用以及生長素的氧化等有關；在植物生長發育過程中它的活性不斷發生變化。因此，測定過氧化物酶的生物活性或其同工酶可以了解某一時期植物體內代謝的變化。 凝膠電泳兼有電荷效應和分子篩效應。被分離物質由於所載電荷數量、分子大小和形狀的差異，在電泳時產生不同的泳動速率而相互分離。利用過氧化物酶能催化H2O2把聯苯胺氧化成藍色或棕褐色產物的原理，將經過電泳後的凝膠置於有H2O2及聯苯胺的溶液染色，出現藍色或棕褐色部位即為過氧化物酶同工酶在凝膠中存在的位置，多條有色帶即構成過氧化物酶同工酶譜。2、儀器：高速冷凍離心機（10000r）、垂直板電泳槽，直流穩壓電源（電壓300－600V，電流50－100mA，移液管（1，5，10ml），燒杯（25，50，100ml），細長頭的滴管，1ml注射器以及6號長針頭，微量注射器（10µL或者50µL），培養皿（直徑120mm），玻璃板（13*13cm），玻璃紙兩張，日光燈一臺。3、試劑：分離膠緩衝液（Tris-HCl緩衝液 pH8.9）、Acr－Bis貯存液、0.14%過硫酸銨（新鮮配製）、TEMED、電極緩衝液pH8.3（用時稀釋10倍）、40%蔗糖溶液（內含少量溴酚藍）、聯苯胺、pH8.0樣品提取液、7%冰乙酸、pH4.7的乙酸緩衝液。四、實驗步驟
1.正確安裝垂直板電泳槽（參照 「垂直板聚丙烯醯胺凝膠電泳法」 內容）3.製備樣品4.加樣
凝膠聚合後繼續放置30min，雙手輕輕去除樣品槽模板用濾紙吸去殘留液體。將玻璃板翻轉重新放入並夾緊。內外槽中加入電極緩衝液，內槽液面沒過短板0.5cm。用微量注射器取5-15µL上述混合液，通過緩衝液，小心的將樣品加到凝膠凹形樣品槽底部，待所有凹形樣品槽內都加了樣品，即可開始電泳。
5.電泳
將直流穩壓電泳儀的正負極與電泳槽裝置的正負極分別連接，打開電泳儀開關。樣品進膠前電流控制在15～20mA，大約15～20min；樣品進入凝膠以後，再將電流調至20-30mA，保持電流強度不變。待指示染料遷移至下沿約0.5 cm處停止電泳。 在膠板一端切除一角作為標記，滑入盛有pH4.7的乙酸緩衝液的玻璃皿中浸泡10min。倒去乙酸緩衝液，加聯苯胺淹沒膠片，於室溫下顯色20 min，即得到過氧化物酶同工酶的藍色或紅褐色酶譜。倒掉染色液，重新加入7%的冰乙酸溶液，於日光燈下觀察記錄酶譜，繪圖或照相。