可實現受損關節替換的軟骨再生3D生物列印

2020-12-15 騰訊網

江蘇雷射聯盟導讀：

關節軟骨是關節中的彈性結締組織。軟骨損傷是非常普遍的現象，但由於軟骨的低細胞性和無血管性質，使其自我修復能力有限。軟骨損傷是關節功能障礙的常見原因，現有的關節假體還不能與宿主關節組織一起重塑，因此軟骨/關節重塑仍然是相當大的挑戰。

在臨床實踐中，使用金屬及合成材料假體的全關節置換手術可以取代患有關節炎的關節。因為目前關節假體還不能與周邊關節組織一起重塑，並且可能由於無菌性鬆動或感染而導致長期功能損傷，只能通過關節的生物性再生來解決。2020年9月9日，來自南京醫科大學附屬第一醫院、上海交通大學醫學院附屬第九人民醫院、蘇州市立醫院北區（南京醫科大學附屬醫院）和東華大學的骨科、轉化研究和高分子科學領域的科學家團隊在Science Advances上發表了"3D bioprinting dual-factor releasing and gradient-structured constructs ready to implant for anisotropic cartilage regeneration"，使用間充質幹細胞(MSC)移植，然後向軟骨細胞刺激定向分化已成為軟骨修復的首選方法。臨床研究表明，關節軟骨損傷總是深深地延伸到軟骨下骨中，從而在膝關節中引起軟骨缺損，這可以改變關節的生物力學特性並影響軟骨組織的長期功能，這表明了同時修復膝關節和修復全層各向異性關節軟骨的重要意義。

隨著關節軟骨從淺表區過渡到深層區，軟骨的細胞外基質(ECM)沉積和細胞類型中的梯度和各向異性結構可在深區（血管向內生長）提供出色的滲透性，並提供所需的機械支撐。然而，在軟骨修復中，開發模仿梯度各向異性結構的仿生構造和不同層中的信號傳導方法以誘導區域依賴性軟骨形成分化和ECM沉積是非常具有挑戰性的。根據之前的科學研究，具有較小孔徑（100至200μm）的支架可以更好地促進骨軟骨再生中的軟骨形成。然而，在這些具有小孔徑的支架中，成骨作用和血管生成受到抑制，由於這些支架中的微血管向內生長減少，因此顯示出更少的營養物質擴散和更壞的組織整合。在許多研究中已經報導了水凝膠用於軟骨再生，但是由於結構完整性、機械穩定性和可印刷性不足，仍然難以用水凝膠構造大規模的組織結構。在這裡，研究人員開發了雙因子釋放、梯度結構的MSC負載結構的3D生物列印，並通過對動物植入建立全層軟骨再生進行測試。

圖1. 研究設計和支架結構的示意圖

△圖解：(A)示意圖的研究設計與兔子關節軟骨再生的3D生物列印的雙因素釋放和梯度結構的載有MSC的構建體。各向異性軟骨支架的結構示意圖和研究設計。(B)使用計算機輔助設計（CAD）模型來設計四層梯度PCL腳手架結構，以提供BMS用於各向異性軟骨生成和深層營養物供應（左）。梯度各向異性軟骨支架是通過一步一步3D生物列印梯度聚合物支架結構和雙蛋白釋放複合水凝膠與生物墨水構成的，該複合水凝膠將BMSC與BMP4或TGFβ3μS作為BCS封裝成軟骨細胞（中間）。當移植到動物模型中時，各向異性軟骨構建體為各向異性關節軟骨的仿生再生提供了BMSC和差異蛋白的結構支持和持續釋放（右）。

圖2. 用於植入的3D生物列印梯度軟骨支架。

△圖解：(A)(a)人和(b和c)兔子的軟骨支架的總體外觀（b，間距為150μm的NG; c，間距為750μm的NG）。在SEM圖像上方還顯示了兔軟骨支架的頂視圖(d，間距為150μm的NG; e，間距為750μm的NG; f，間距為150至750μm的梯度支架)(g， 150μmNG支架採用水平截面；h為垂直截面)，以證明印刷支架中PCL纖維的精確對準。(B)解構梯度支架。梯度支架的結構被解構為四層。在每一層中水凝膠-PCL複合結構的微觀外觀顯示出良好的互連性和每一層的精細，有序排列的結構。(C和D)在用活/死測定（綠色，活細胞；紅色，死細胞）印刷後，分別在淺層和深層顯示出良好的細胞活力(C)在顯微鏡下和(D)在共聚焦顯微鏡下。DAPI，4'，6-二mid基-2-苯基吲哚。(E)細胞通過細胞骨架染色在淺層和深層擴散。(F)在淺層和深層中對軟骨標誌物進行免疫染色。潤滑標記的COL2A1和PRG4的表達在具有小孔徑的表層(a和b)中顯著較高，而深層(c和d)的軟骨細胞主要表現為肥大表型。圖片來源：南京醫科大學附屬第一醫院。

3D生物列印軟骨結構

該團隊使用3D生物列印技術開發了用於關節重建的不同關節組織構造。他們通過包括具有多種生長因子釋放結構的生化刺激物（BCS）和具有小孔徑以誘導軟骨形成的生物力學刺激物（BMS）來模仿天然軟骨。然後，他們創建了第三個軟骨構造作為雙重刺激（DS）組，以包括兩種形式的刺激。對於生長因子，研究小組在軟骨構造中選擇了骨形態發生蛋白（BMP4）和轉化生長因子β3（TGFβ3）的組合，以再生複雜的不均勻關節組織。然後研究人員開發了可遞送生長因子的水凝膠，並使用了聚乳酸-乙醇酸（PLGA）微球作為載體/載體。該團隊為BMS（生物力學刺激）組和BCS（生化刺激）組維持恆定的纖維間距，以開發非梯度支架，同時在DS（雙重刺激）組中為支架引入逐漸變化的纖維間距。科學家還使用了聚己內酯(PCL)聚合物，並將其整合到仿生支架結構中。通過這種方式，他們開發了使用4 x 4 x 4 mm支架的兔軟骨支架和使用14 x 14 x 14 mm支架的人軟骨支架。

△使用OPUS系統的3D列印過程顯示了水凝膠-PCL圖案化和每一層以及整個軟骨構造的梯度微通道。來源：Science Advances

為了測試生長因子對骨髓基質細胞孫等在水凝膠中培養骨髓間充質幹細胞七天。首先在實驗室中釋放出持續可控體積的生長因子，然後科學家們在列印的支架上進行細胞存活和增殖試驗，以記錄生物列印後60分鐘(第0天)、7天和21天骨髓間充質幹細胞的存活情況。活細胞在第0天顯示細胞活力增加，隨後從第3天至第21天持續生長。21天後，研究人員注意到支架上良好的三維細胞錨定，並且該工作表明在實驗室中為骨髓間充質幹細胞生長和分化形成軟骨細胞發展了有利的微環境。

軟骨植入物在兔膝關節軟骨缺損模型中較好的修復效果

研究團隊用兔子實驗模型測試軟骨支架在膝關節修復過程中的能力。他們使用一步三維生物列印來構建支架，以提供結構支撐和細胞的持續釋放。實驗促進了天然關節軟骨的仿生再生，並且與骨形態發生蛋白組和骨橋蛋白組相比，雙刺激實驗組的植入物在缺損部位顯示出更好的整合。該小組用以下儀器監測移植部位磁共振成像24周後(6個月內)關節軟骨明顯癒合。結果顯示，與BCS或BMS動物組相比，DS組的軟骨修復和關節管理更好。

圖3. 雙因子釋放和梯度結構軟骨支架在兔膝關節軟骨缺損模型體內顯示出更好的各向異性軟骨修復效果。

△圖解：(A)在8、12和24周時，支架植入過程和修復軟骨的總體外觀。對手術的膝關節（第五行）進行了MRI檢查，結果表明，對於DS支架移植的關節，軟骨下水腫和關節表面（白色箭頭）的癒合明顯更好。(B至F)通過(B)在體內植入過程中修復的軟骨組織的組織學評分評估，比較了支架的軟骨保護作用。(C)植入支架的兩組患者的(C)Mankin評分和(D)ICRS（國際軟骨修復協會）股骨dy（FC）和脛骨平臺（TP）的關節軟骨組織學評分。土著組和其他組之間的* P

該團隊觀察了關節軟骨從淺層向深層的過渡，並測試了生成的軟骨與天然軟骨的比較特性。如前所述，與其他組(基底細胞組和骨髓組)相比，支架顯示向內生長的微血管生長改善。通過這種方式，研究人員為關節重建、關節軟骨再生和功能性膝關節生成了具有結構完整性的3D生物列印各向異性構建體關節軟骨兔子模型的構建。3D生物列印的功能性結構在關節置換過程中充當假體軟骨修復癒合動物模型中受傷或退化的關節。

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