引言
骨髓間充質幹細胞（MSCs）可以誘導外周耐受並向受損組織遷移，通過減輕炎症預防關節炎，通過軟骨分化治療關節軟骨，避免或推遲關節置換手術，但是MSCs的靶向效率較低。因此，有研究團隊提出用機器人來攜帶MSCs來靶向運送。作為進一步的問題，最近的微型機器人研究集中在使用EMA系統的微型機器人的製造和磁靶向。因為如果沒有磁性固定，這些微型機器人可能會從缺陷區域脫落。但遺憾的是，由於EMA系統體積大、功耗高，不僅難以連續產生磁場，而且限制了患者的活動。
Gwangjun Go團隊之前展示了一種磁性微型機器人的概念證明。這種微型機器人由聚乳酸-乙醇酸共聚物(PLGA)微支架組成，其中含有聚乙烯亞胺(PEI)包裹的磁性納米顆粒(MNPs)，已知通過PLGA的水解在幾周內消失，但以前的工作沒有證實其降解。此外，PEI包被的MNPs不能生物降解，並導致細胞死亡和細胞抑制。雖然微型機器人的生物相容性得到了驗證，但PLGA降解後殘留的PEI包裹的MNPs會影響周圍的細胞和組織。
PEI需要與其他單體共聚以促進其降解。因此，需要使用包覆有非細胞毒性物質的MNPs或在體內進行驗證，才能進入微型機器人的臨床階段。其次，EMA系統與目前的醫學成像設備，如X射線成像設備和關節鏡不兼容，因為它不是為活體應用而設計的。除了微型機器人和EMA系統之外，微型機器人打靶後的條件--例如微型機器人在目標病變中的穩定固定、微型機器人的降解和細胞存活等。
在這項研究中，Gwangjun Go團隊團隊提出了一種基於人類脂肪衍生MSC(HADMSC)的膝關節軟骨再生醫用微型機器人系統，並進行了體內試驗，以驗證該微型機器人使用軟骨缺損模型的有效性，並考慮到臨床試驗的批准。這個微型機器人系統可以通過針基注射、靶向和固定微型機器人來實現包含微創操作的MSC靶向遞送。如圖1所示。
（圖1. 通過磁性微團簇在PLGA微支架上的吸附和MSCs的負載，通過順序工藝製備了含有MSCs的磁性微機器人(步驟1)。用EMA系統將製備的MSC負載微型機器人送入軟骨缺損處(步驟2)。在定向輸送程序之後，使用永磁體將微型機器人固定到缺陷處(步驟3)）
微機器人是通過順序形成PLGA微支架並在其表面吸附磁性微團簇來製造的，檢測結果如圖2所示。
（圖2.(A)磁性微團簇的SEM圖像。(B)去離子水中磁性微團簇的尺寸分布。(C)顯示阿魏酸甲酯和磁性微粒離子表面電荷的Zeta電位圖。(D)磁性微型機器人的掃描電鏡圖像。頂部和底部：分別為微型機器人的整體3D多孔結構和孔隙形態。(E)微型機器人的EDX圖譜，主要由碳、氧和鐵組成。(F)微型機器人及其毛孔的大小分布。(G)殼聚糖、阿魏酸甲酯、磁性微團簇、PLGA微支架和微型機器人的FTIR光譜。A.U，任意單位。(H)磁性微團簇、PLGA微支架和微機器人的熱重分析曲線。(I)用溶菌酶溶液處理的微型機器人的光學顯微鏡和掃描電鏡圖像。第33天，上、下部掃描電鏡圖像的標尺分別為10 0和2 0mm。(J)溶菌酶溶液作用下微型機器人的直徑隨時間的變化(n>13)。(K)顯示微型機器人對物理震動和磁力的反應的照片。(L)用VSM測量了阿魏酸甲酯、磁性微團簇和微機器人的磁滯曲線）
首先，通過水包油(w-o-w)乳狀液對明膠進行淋濾形成PLGA微支架。隨後，被FDA證實臨床應用安全的阿魏酸甘油被用於MNPs中，為PLGA微支架提供磁驅動能力。阿魏醇的小尺寸(30 Nm)和較高的負離子電荷為大劑量提供了較高的膠體穩定性和安全性，但PLGA微支架的有限比表面積和較強的負離子電荷幹擾了阿魏醇在其表面的吸附。因此，生物相容性和生物可降解性的殼聚糖作為陽離子聚合物被用於形成磁性微團簇，以誘導MNPs聚集以增大尺寸和改變離子電荷。最後一步將製備的磁性微團簇吸附在PLGA微支架上。
為了驗證微型機器人的安全性，研究團隊設計了一系列的安全檢測實驗如細胞毒性實驗，增殖分化實驗等，結果（見圖3）都表明規定條件下製備的微型機器人不影響分化能力，並為細胞生長提供合適的環境。
圖3. (A)阿魏酸鈉(0~6 4mg ml1)和磁性微團簇處理2 4h後的細胞毒性評價(n=3；*P<0.0 5，學生t檢驗)。(B)細胞在PLGA微支架和微型機器人中培養24小時後的細胞毒性評價(n=4)。(C)每個微型機器人植入5000個細胞後，按孵化時間計算附著在微型機器人上的細胞數目。(D)hADMSC-微型機器人的共聚焦圖像，其中MSCs在微型機器人中孵育24小時。紅色和藍色分別代表細胞質和細胞核染色。(E)hADMSC在微型機器人和PLGA-微支架中增殖1~22天(n=3)。(F)在軟骨分化培養基中培養21d後分化的hADMSC-微型機器人圖像。紅色和藍色分別表示COLII和細胞核的表達。(G)21d後軟骨特異性基因的表達(n=3；*P<0.05和**P<0.01，t檢驗)。
在微機器人打靶電動助力系統的設計與性能這塊，微機器人的瞄準精度與磁場方向和缺陷形成的磁力有關。因此，單個磁鐵在準確輸送除髕骨以外的內髁缺損的微型機器人方面有一定的局限性。而由多個電磁線圈組成的EMA系統可以在3D空間的期望方向上產生磁場，這種EMA系統作為膝關節軟骨再生的微型機器人靶向裝置(圖1中的步驟2)。EMA系統的電磁線圈的數量和布置是根據微型機器人的操縱區域，DOF（根據微型機器人的形狀）以及體內情況（包括接近患者膝蓋，醫護人員和醫療人員的情況）而設計的成像設備。在EMA系統設計參數的基礎上，通過優化程序得到最優線圈配置，形成所有線圈配置，並對每種線圈配置的工作空間性能進行分析（圖4A、4B、4C）。在微型機器人的3D打靶測試（圖4D）中發現EMA系統對微型機器人的磁製導比單獨注射微型機器人的靶標效率有了顯著的提高（圖4E）。為了確認EMA系統在體內應用的可行性，作者團隊使用關節鏡系統在豬膝關節上進行了體外靶向測試（圖4F）。結果證實，體外靶向試驗結果與微型機器人3D靶向試驗結果相似，利用EMA系統進行的微型機器人靶向可以用於膝關節軟骨再生。
（圖四。(A)顯示EMA系統與成像設備相結合的照片。(B)微型機器人在不同磁場和梯度(n>3)下的移動性。(C)微型機器人的活動度隨細胞負荷的變化(n=4)。(D)不同模體的3D目標測試示意圖(左)。電影截圖(右)顯示了在B孔使用和不使用EMA系統的微型機器人的目標。(E)微型機器人在每個洞的打靶效率(n>5；*P<0.001，學生t檢驗)。(F)微型機器人瞄準離體豬膝關節內側髁(左)和髕骨(右)缺損時的時間推移圖像序列。在每幅圖像中，膝關節模型中的紅色箭頭指示缺陷位置。時間以分鐘：秒的格式顯示在每個圖像上。）
為了穩定地固定位於缺陷中的微型機器人，需要在缺陷內部產生來自磁固定裝置的磁場，但是允許一定的磁場誤差。可以用磁鐵來產生磁力，在模擬髕骨缺損模型的模體中進行了微型機器人靶向測試。靶向試驗而非固定試驗表明，該磁體在髕骨缺損中不僅具有99.5±1.45%的靶向效率，而且克服了微機器人注射形成的流體漩渦。可是與髕骨缺損不同，內髁的缺損位於垂直於股骨的位置。為了固定瞄準內髁缺陷的微型機器人，需要形成一個垂直於股骨的磁力來面對缺陷。而磁鐵植入需要對軟骨下骨進行侵入性的鑽孔和大切口手術，這種方法導致了患者較長的恢復期。為了將微型機器人固定在內髁的缺損中，同時避免這些磁源的植入，磁鐵可以附著在脛骨的膝關節皮膚上和股骨遠端(圖5A)。通過數值模擬分析了缺陷區域內磁體產生的磁場和梯度。如圖5B所示。
此外，作者團隊測量了磁體在45個位置產生的磁場，並與仿真結果進行了比較(圖5C)。各位置的實測磁場與仿真結果相差不大，相差1.92%。該誤差是由於磁體與釹類磁體的剩磁不對準造成的。由於外部震動，大量微型機器人退出了缺陷區域（圖5D，左），而用磁鐵進行磁固定幾乎將微型機器人保留在缺陷內部（圖5D，右）。微型機器人無磁鐵固定率為68%，有磁鐵固定率為97%(圖5E)。為了確定微型機器人打靶後磁體的磨損周期，作者團隊進行了微型機器人在軟骨組織上的粘附試驗。將100個hADMSC-微型機器人放置在離體豬軟骨標本的缺損處，觀察微型機器人在0、1、2和3d的粘連情況，這取決於有無磁鐵（圖5F）。
（圖5.(A)兔膝關節磁鐵放置示意圖。黑色虛線盒內部的磁場和梯度圖顯示了軟骨缺損的數值模擬結果。藍色虛線框內的圖形顯示了磁鐵尺寸的優化。(B)缺陷區域內磁體產生磁場的數值模擬結果。在每張磁場圖中，虛線上的三個紅點(A、B和C)用於比較測量的磁場和模擬的磁場。(C)在缺陷區內的45個位置模擬(A-s、B-s和C-s)和測量(A-m、B-m和C-m)磁場。(D)在無磁鐵和有磁鐵的情況下進行的微型機器人固定試驗的時間推移圖像。在插圖中放大了編號箭頭附近的區域。比例尺，3 mm。時間以分鐘：秒的格式顯示在每個圖像上。(E)無()和(+)磁鐵微型機器人的固定率(n=3；*P<0.001，學生t檢驗)。(F)根據細胞載量、磁鐵使用和細胞培養天數計算微型機器人的粘附率(n=3；*P<0.05，學生t檢驗)。MR，微型機器人；HMR，hADMSC-微型機器人；ns，不顯著。）
在微型機器人系統進行軟骨再生的活體驗證中可以得出使用EMA系統的磁靶向不僅可以應用於流體中，還可以應用於關節空間的充氣環境中；微型機器人不刺激導致炎症的促炎基因的表達；微型機器人系統通過增加hADMSC-微型機器人的輸送，改善了軟骨再生的效果等結論。
雖然所提出的幹細胞介導的微型機器人系統已被證明適用於體內軟骨再生，但仍有一些技術問題需要改進或開發，才能應用於未來的臨床試驗。
首先，需要開發一種微型機器人注射裝置，以穩定地注射細胞加載的微型機器人。其次，與兔子不同，人類的關節運動可以在醫務人員的控制下最小化。最後，所提出的細胞負載微型機器人的安全性需要通過體內試驗進行長期的評估，此外，使用微型機器人系統的膝關節軟骨再生應該在膝關節與人類相似的大動物身上進行。
參考資料：Go et al., Sci. Robot. 5, eaay6626 (2020) 22 January 2020