前言
2020年10月Science期刊發表的題為 「Multi-omics analyses of radiation survivors identify radioprotective microbes and metabolites」的研究成果，通過16S rRNA基因測序和代謝組學研究方法，探究了腸道菌群與放療輻射的相關性，發現了具有防護作用的特徵微生物菌群和代謝物，首次探究腸道菌群對放療輻射的保護機制，為其臨床研究提供了理論依據和基礎。
中文標題：多組學分析可識別輻射倖存者的輻射防護微生物和代謝物
英文標題：Multi-omics analyses of radiation survivors identify radioprotective microbes and metabolites
研究對象：糞便樣本
發表期刊：SCIENCE
影響因子：44.372
發表時間：2020.10.30
運用生物技術：16S rRNA基因測序、靶向代謝組學+非靶代謝組學
研究背景
大劑量電離輻射的毒性會誘發急性輻射綜合症，進一步表現為造血、胃腸道和腦血管綜合症。腸道是輻射的主要目標，也是腸道菌群的生長場所。儘管少量描述性研究已顯示腸道菌群與輻射引起的損害之間存在潛在相關性，但其基礎仍然不清楚。
作者發現一種C57BL/6J小鼠在高劑量的全身輻射中能存活下來，它們與不能在輻射中倖存的小鼠具有相同的遺傳背景，因此促使研究方向轉向尋找與放射防護有關的微生物群差異。為了更好地了解腸道微生物組與輻射誘發的損傷之間的相互作用，作者進行了微生物群過繼轉移實驗以及單關聯研究，以研究腸道輻射模型中腸道細菌群落和特定細菌菌株的功能，並通過代謝組學技術發現了在放射防護中起重要作用代謝物。
實驗思路
研究方法
1.實驗對象
6-8周野生型C57BL / 6J小鼠（雄性和雌性）全身經過8.0至9.2 Gy的輻射（未經受輻射小鼠作為對照組）。經過輻射30天後未表現出損傷或傷害的小鼠被認為是精英倖存者。輻射後第290天，收集糞便樣本進行微生物組分析。
2.防輻射效果驗證試驗
（1）髒籠共享實驗
將六至八周大的SPF C57BL / 6J小鼠關在對照組和精英倖存者生活過的帶有糞便的髒籠子中，持續8周每周將小鼠轉移到新的髒籠中，最後一天這些小鼠接受高劑量的全身輻射，輻射前收集糞便DNA用於微生物組分析。
（2）糞菌移植（FMT）實驗
GF或SPF C57BL / 6J小鼠每周兩次服用對照組和精英倖存組的糞便，持續4周（GF受體）或8周（SPF受體），最後一次FMT後接受高劑量輻射，輻射前收集糞便DNA用於微生物組分析。
（3）服用益生菌實驗
SPF C57BL / 6J小鼠先接受抗生素治療（20 mg鏈黴素/小鼠）一天後，每周兩次給小鼠餵食Lachnospiraceae(毛螺菌科)菌株，持續8周。最後一次給藥後，接受者接受高劑量的全身輻射治療。
（4）短鏈脂肪酸（SCFA）和色氨酸治療實驗
3、輻射臨床效果評價實驗
（1）組織病理學實驗：脾臟，股骨，小腸和結腸；
（2）腫瘤接種和放射治療；
（3）粘蛋白的免疫標記以及測量粘液層和隱窩長度；
（4）腸通透性檢測，骨髓幹細胞內ROS水平檢測；
（5）分離骨髓幹細胞、腸上皮細胞和腸上皮內淋巴細胞；
（6）免疫印跡分析：骨髓幹細胞，腸上皮細胞，腸上皮內淋巴細胞或脾臟組織；
（7）流式細胞儀分析；
4、組學實驗
（1）16S rRNA基因測序；
（2）代謝組學實驗：短鏈脂肪酸靶向定量檢測；LC-MS非靶向代謝組學；
5、其他臨床數據
21名白血病患者接受放療前的糞便；
研究結果
1、精英倖存者存在獨特的微生物
經過高劑量輻射（9.2 Gy）後，有5至15％的SPF C57BL / 6小鼠（被稱為「精英倖存者」）可以長期存活（600天以上）（圖1A）。為了確定腸道微生物群是否對精英倖存者具有特異性，作者在輻射後第290天對糞便微生物進行了高通量16S rRNA基因測序分析，分析結果顯示，精英倖存者與對照組相比具有獨特的微生物群落（圖1B）。可通過UniFrac差異距離分析（圖1C）進一步量化數據，並得到微生物分類單位的熱圖（圖1D）。從這些結果可推測：特定腸道菌群可以防止輻射損傷。
圖1 | 與對照組相比，「精英倖存者」有獨特的腸道菌群
2、微生物群介導的放射防護
（1）髒籠實驗證實精英倖存者的微生物群可促使宿主抵抗高劑量輻射
在精英倖存者（ES-Recip）髒籠中飼養的小鼠（接受者）有近75％能在高輻射下存活，而在對照組（Ctrl-Recip）髒籠中飼養的小鼠只有20％存活（圖2B）。ES-Recip（圖2C）小鼠的臨床評分顯著較低。組織學研究結果表明，與Ctrl-Recip小鼠相比，ES-Recip骨髓標本基質損傷減少、胱天蛋白酶3標記的造血細胞死亡減少以及Ki67染色增強。ES-Recip小鼠的脾臟結構接近正常，白色牙髓富含淋巴細胞的卵泡，紅色牙髓表現出髓外造血。相反觀察到Ctrl-Recip脾臟明顯萎縮和淋巴細胞減少。在來自ES-Recip小鼠的脾臟中也觀察到裂解的半胱天冬酶3染色和免疫印跡的減少以及Ki67染色增加。這些結果表明，精英倖存者的微生物群可通過促進造血細胞增殖和減少細胞死亡來介導宿主抵抗高劑量輻射。
16S rRNA基因測序分析結果顯示，與Ctrl-Recip小鼠相比，ES-Recip小鼠的微生物組組成有所不同（圖2，D和E）。即與對照組相比，Erysipelotrichales菌豐度顯著下降，同時精英倖存者中擬桿菌和梭狀芽胞桿菌的豐度增加。接受者的微生物組組成與其各自供體的相似，表明髒籠共享策略可以有效地將腸道菌群從提供者交換到接受者（圖2D）。
（2）糞便微生物群移植（FMT）實驗證實微生物與輻射防護的關係
FMT實驗發現，精英倖存者使GF和SPF小鼠的存活率提高，與對照小鼠相比，臨床得分降低（圖2，I和J）。使用線性判別分析（LDA）直接比較GF ES-Recip和Ctrl-Recip小鼠的糞便微生物豐度，ES-Recip小鼠中八種分類單元增加，而五種分類單元減少（圖2M）。火山圖顯示， Lachnospiraceae（毛螺菌科）是ES-Recip小鼠中最豐富的微生物（圖2N）。
圖2 | 來自精英倖存者的腸道菌群可以保護GF和SPF小鼠免受輻射誘發的死亡
（3）輻射防護微生物群與人類相關性研究
使用16S rRNA基因測序鑑定21位白血病患者腸道微生物組成，分析了所有患者的鏈黴菌和腸球菌的豐度（圖3，A和B）。腹瀉持續時間較短（<10天）的患者與腹瀉持續時間較長（> 10天）的患者相比，鞭毛藻科和腸球菌的豐度明顯更高，乳桿菌科也有增加的趨勢，在患者中，Lachnospiraceae（毛螺菌科）豐度與胃腸道不良反應的發生之間存在統計學的顯著負相關（圖3B）。
圖3 | 無論是患者還是小鼠腸道菌群與輻射防護顯著相關
3. 小鼠微生物群的放療後選擇
與人類不同，實驗所用小鼠應具有相似的基礎微生物組組成。為了解精英倖存者攜帶放射防護菌群的原因，作者調查了在輻射前後是否選擇了一個獨特的微生物菌群在精英倖存者中佔主導地位（圖3C）。對57隻SPF C57BL / 6小鼠進行了高劑量的全身輻射（8.2 Gy），並在放射治療前（第1天）和第2、7、21和30天收集糞便樣本進行16S rRNA基因測序，存活超過30天的小鼠被認為是精英倖存者。輻射前（第1天）精英倖存者和非倖存者之間的微生物組成沒有差異。但輻射後第7天，精英倖存者有一個與輻射後死亡小鼠不同的微生物群落（圖3E）。與輻射致死的小鼠相比，具有Lachnospiraceae（毛螺菌科）和Enterococcaceae（腸球菌科）的小鼠在放療後的第7天顯示出更高的存活率（圖3F）。這些數據表明，放射治療對精英倖存者的兩種菌群具有選擇性。
作者對Lachnospiraceae（毛螺菌科）和Enterococcaceae（腸球菌科）介導的放射防護進行深入研究。向SPF C57BL / 6小鼠接種4種微生物（圖4A），前兩種為Lachnospiraceae（毛螺菌科）和Enterococcaceae（腸球菌科），後兩種為對照菌群，通過FMT實驗發現前兩種菌群能減輕放射的副作用，在放療條件下具有放射防護作用。
圖4 | 毛螺菌改善了輻射誘發的症候群
4. 防護輻射的代謝介質
Lachnospiraceae（毛螺菌科）可產生短鏈脂肪酸（SFAC，維持腸道上皮以及調節免疫系統和炎症反應的重要底物）。實驗發現精英倖存者或ES-Recip小鼠的糞便樣品中三種SCFA（乙酸、丁酸和丙酸）的濃度均高於對照。丁酸酯也顯示出明顯的上升趨勢，並且ES-Recip小鼠中的丙酸酯和總SCFA含量顯著升高。為了確認SCFA在微生物群介導的放射防護中的作用，作者測量了高產或低產Lachnospiraceae（毛螺菌科）產生的SCFA數量，並且確認三種高產菌株進行的處理組可保護100％的小鼠免於輻射，而這三種低產菌株僅提供50％的保護。
圖5 | 商業相關的SCFA抑制輻射引起的死亡和傷害
組織學分析表明，丙酸酯處理導致骨髓細胞增多，脾臟白、紅髓恢復（圖5D）。此外丙酸減弱了輻射誘導的粒細胞-巨噬細胞祖細胞（GMP），普通髓樣祖細胞（CMP）和巨核紅細胞祖細胞（MEP）的減少。通過Western blot檢測與DNA損傷相關的蛋白質的水平，包括gH2AX（圖5G）、p53和53BP1。與未接受輻射的小鼠丁酸或丙酸酯相比，ROS水平降低了50％至60％。最終作者認為Lachnospiraceae（毛螺菌科）可提供長期保護，其中丙酸保護作用長達 400天以上（圖5I）。
為了確定其他代謝物是否具有放射防護作用，對自精英倖存者和對照組的糞便樣本進行了非靶標代謝組學測定。精英倖存者和對照之間的代謝產物差異很大（圖6A和B），共找到141個差異代謝物。精英倖存者糞便中代謝最豐富的代謝產物聚集在色氨酸代謝途徑中，其中吲哚3-甲醛（I3A）含量變化了5倍，而犬尿酸（KYNA）變化了8倍（圖6C和D）。對這些色氨酸代謝產物進行了體內放射線抑制測試，發現這兩種代謝物均能顯著提高放射處理的SPF小鼠的存活率並降低其臨床評分（圖6E至G）。I3A和KYNA治療組均顯示約75％的存活率，且放射後的保護持續時間超過200天（圖6H）。
圖6 | 非靶向代謝組學顯示色氨酸代謝物是有效的輻射防護物
相關討論
腸道微生物及其代謝組可對輻射誘發的小鼠損傷提供實質性的保護：
研究表明Lachnospiraceae和Enterococcaceae的存在與恢復造血功能和修復胃腸道有關。在接受放射治療的白血病患者中，這兩種微生物分類更為豐富，且表現出輕度的胃腸道功能障礙。丙酸以及兩個色氨酸途徑代謝產物（I3A和KYNA）在精英倖存者中升高，並提供了長期防輻射保護。表明腸道微生物群及其代謝產物可延遲放射損傷並延長生命。
短鏈脂肪酸可以在放射後直接促進造血作用和腸道修復，通過降低促炎細胞因子水平或誘導抗炎細胞因子白細胞介素-10，廣泛抑制全身性炎症。此外本研究表明色氨酸代謝產物I3A和KYNA可以抵抗ARS。色氨酸代謝物也能減弱促炎細胞因子的反應，非靶向代謝組學方法顯示色氨酸代謝物在放射倖存者中升高。色氨酸代謝物可以直接減少輻射引起的損害，是候選的輻射防護劑。除色氨酸代謝物外，精英倖存小鼠中其他代謝物也升高。需要進一步的研究確認它們是否也具有輻射防護。
研究結果
過量輻射會導致急性輻射綜合症，從而導致造血，胃腸道和腦血管損傷。作者調查了從高劑量輻射中仍有正常壽命的小鼠種群，這些「精英倖存者」擁有獨特的腸道菌群，這些菌群在無菌和常規飼養的接受者中保護它們免受輻射引起的傷害和死亡。
Lachnospiraceae和Enterococcaceae菌群家族的豐度升高與放射後造血功能的恢復和胃腸道修復有關。這些菌群含量更高的白血病患者接在接受放射治療後表現出較輕的胃腸道功能障礙。對小鼠的代謝組學研究揭示了精英倖存者糞便中微生物產生的丙酸和色氨酸代謝物濃度增加，這些代謝物引起長期放射防護，減輕了造血和胃腸症候群，並降低了促炎反應。
小鹿推薦
本研究首次揭示了腸道菌群和放療輻射之間潛在的相關性，並找到了一些關鍵代謝產物。文章通過微生物16S rRNA基因測序分析，找到通過精英倖存者小鼠特有腸道菌群，使用特有的「髒籠實驗」，並結合臨床病例，揭示了不同菌群和短鏈脂肪酸代謝相關的保護機制，並使用非靶向代謝組學手段找到了具有放射防護功能的色氨酸代謝物。實驗設計詳實、邏輯性強、數據充分，實驗結果具有較大的臨床轉化意義。是一篇基礎研究和臨床研究結合的典範。
16S+代謝組學 /鹿明生物/
本文運用腸道菌群16S rRNA基因測序+代謝組學研究首次揭示了藏到菌群和放療輻射之間潛在的相關性，並找到了一些關鍵代謝產物。鹿明生物針對16S+代謝組學特推出了多組學研究活動，助力各位老師的組學研究~
參考文獻：
1. M. Hauer-Jensen, J. W. Denham, H. J. Andreyev, Radiation enteropathy: Pathogenesis, treatment and prevention.Nat. Rev. Gastroenterol. Hepatol. 11, 470–479 (2014).
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5. M. A. Ciorba et al., Lactobacillus probiotic protects intestinal epithelium from radiation injury in a TLR-2/cyclo-oxygenase-2-dependent manner. Gut 61, 829–838 (2012).
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文章來源於鹿明生物