| DNA的變性 DNA的復性 核酸分子雜交 變性(denaturation)和復性(renaturation) 是雙鏈核酸分子的二個重要物理特性。也是核酸研究中經常引用的術語。雙鏈DNA,RNA雙鏈區,DNA: RNA雜種雙鏈(hybrid duplex)以及其它異源雙鏈核酸分子(heteroduplex) 都具有此性質。 (1)DNA的變性： 指DNA分子由穩定的雙螺旋結構松解為無規則線性結構的現象。確切地就是維持雙螺旋穩定性的氫鍵和疏水鍵的斷裂。斷裂可以是部分的或全部的，是可逆的或是非可逆的。DNA變性不涉及到其一級結構的改變。凡能破壞雙螺旋穩定性的因素都可以成為變性的條件，如加熱、極端的pH、有機試劑甲醇、乙醇、尿素及甲醯胺等,均可破壞雙螺旋結構引起核酸分子變性。變性能導致DNA 以下一些理化及生物學性質的改變。 溶液粘度降低。DNA雙螺旋是緊密的"剛性"結構,變性後代之以「柔軟」 而鬆散的無規則單股線性結構，DNA粘度因此而明顯下降。 溶液旋光性發生改變。變性後整個DNA分子的對稱性及分子局部的構性改變, 使DNA溶液的旋光性發生變化。 增色效應或高色效應(hyperchromic effect)。指變性後DNA 溶液的紫外吸收作用增強的效應。DNA分子具有吸收250－280nm波長的紫外光的特性，其吸收峰值在260nm。DNA分子中鹼基間電子的相互作用是紫外吸收的結構基礎,但雙螺旋結構有序堆積的鹼基又"束縛"了這種作用。變 性DNA 的雙鏈解開,鹼基中電子的相互作用更有利於紫外吸收,故而產生增色效應。一般以260nm下的紫外吸收光密度作為觀測此效應的指標,變性後該指標的觀測值通常較變性前有明顯增加, 但不同來源DNA的變化不一,如大腸桿菌DNA經熱變性後,其260nm的光密度值可增加40%以上, 其它不同來源的DNA溶液的增值範圍多在20－30%之間。 以加熱為變性條件時,增色效應與溫度有十分密切的關係,這主要是變性溫度取決於DNA自身的性質。熱變性使DNA分子雙鏈解開所需溫度稱為熔解溫度( melting temperature,簡寫Tm)。因熱變性是在很狹的溫度範圍內突發的躍變過程, 很像結晶達到熔點時的熔化現象,故名熔解溫度。若以溫度對DNA溶液的紫外吸光率作圖,得到的典型DNA變性曲線呈S型。S型曲線下方平坦段,表示DNA的氫鍵未被破壞,待加熱到某一溫度處時,次級鍵突發斷開,DNA迅速解鏈,同時伴隨吸光率急劇上升,此後因"無鏈可解"而出現溫度效應喪失的上方平坦段。Tm定義中包含了使被測DNA的50%發生變性的意義,即增色效應達到一半的溫度作為Tm,它在S型曲線上,相當於吸光率增加的中點處所對應的橫坐標。不同來源DNA間的Tm存在差別,在溶劑相同的前提下,這種差別主要是由DNA本身下列兩方面的性質所造成的。(1)DNA的均一性。有二種含義，首先是指DNA分子中鹼基組成的均一性,如人工合成的只含有一種鹼基對的多核苷酸片段,與天然DNA比較,其Tm值範圍就較窄。因前者在變性時的氫鏈斷裂幾乎可"齊同"進行,故所要求的變性溫度更趨於一致。其次還包含有待測樣品DNA的組成是否均一的意思,如樣品中只含有一種病毒DNA,其Tm值範圍較窄, 若混雜有其它來源的DNA,則Tm值範圍較寬。其原因顯然也與DNA的鹼基組成有關。 總的說,DNA均一性,變性的DNA鏈各部分的氫鍵斷裂所需能量較接近,Tm值範圍較窄,反之亦然。(2)DNA的(G+C)含量。在溶劑固定的前提下，Tm值的高低取決於DNA分子中的(G+C)的含量。(G+C)含量越高,即G-C鹼基對越多,Tm值越高。此點是易於理解的,因G-C鹼基對具有3對氫鍵,而A-T鹼基對只有2對氫鍵,DNA中(G+C)含量高顯然更能增強結構的穩定性,破壞G-C間氫鍵需比A-T氫鍵付出更多的能量,故(G+C)含量高的DNA,其變性Tm也高。實驗說明,Tm與DNA中(G+C)含量存在著密切相關性(圖1-16),從中可看出,變性溫度受到溶液離子強度的影響。Tm與(G+C)含量(X)百分數的這種關係可用以下經驗公式表示(DNA溶於0.2mol/L NaCl中): X%(G+C)=2.44(Tm-69.3) |