氧化石墨烯新應用:抗菌性能的研究

近期，印度卡林加工業技術學院(KIIT)大學的Sasmita Nayak教授（通訊作者）課題組在Advanced Materials上發表近期工作，文章主要報導了天然蟲膠衍生的氧化石墨烯包覆金屬塗層製備的到的複合材料優異的抗菌性能；研究還發現，其中的抗菌活性與金屬體系的電導率直接相關，電導率越高，抗菌活性越好。

【 研究背景 】

石墨烯是一種碳同素異形體，由於其獨特的結構和理化性質，成為人們研究的熱點，它具有二維的平面結構，碳原子為sp2雜化排列。石墨烯的衍生物——氧化石墨烯(GO)和還原氧化石墨烯(RGO)等均是生物相容性化合物，因此，目前它們在生物醫學領域具有廣泛的研究。GO具有類似石墨烯的結構，此外，它還可以用環氧基和羧基裝飾邊緣，由於其具有較高的抗拉強度和耐腐蝕性能，也因此成為優良的塗層材料。以往文獻報導GO可以成功地沉積在各種表面，如棉織物，聚合物纖維，紙，也用作納米塗料以保護底物及發揮抗菌作用，早期的研究也表明石墨烯和金屬納米粒子複合材料具有顯著的抗菌性能。抗菌材料從醫院到廚房臺面有著各種各樣應用，在病原體多藥耐藥的時代，抗生素的治療一直是一個嚴峻的挑戰，研究者們對環境友好、成本有效控制的抗菌治療方法一直在研究探索。

【 研究方法 】

【 研究思路 】

為了推斷蟲膠轉化為氧化石墨烯的可能性，研究者們通過拉曼測試和XPS測試分析了材料的鍵震動以及化合鍵變化。

圖1a給出了直接在金屬襯底上合成GO的示意圖。氧化石墨烯的拉曼光譜數據表明，該光譜分別在1350，≈1600和2710 cm-1處出現D、G和2D峰。D峰和G峰分別對應於兩個碳原子在sp2雜化碳網絡上的缺陷和光學模振動。2D峰是D峰的第一階複色調，對結構缺陷和微觀缺陷都非常敏感。也就是，氧官能團的存在或微結構修飾石墨烯的存在大大降低了2D峰的強度。對蟲膠塗覆玻璃、鋼、鎳、鋅和錫等材料進行加熱後測試拉曼，表明蟲膠碳源產sp2鍵合碳原子。XPS分析有助於判斷連接到碳原子上的sp2碳原子以及氧官能團的類型，連接到氧官能團上的sp2碳原子的峰位置以比對應的未連接的sp2碳原子出現更高的結合能，這是因為在連接到高電子密度氧原子的同時，碳原子的電子密度會降低。此外，峰位的相對變化與所附的氧官能團的吸電子能力有關，此外，這些氧官能團也可以相互關聯以了解觀察結果。

圖一

(a) 直接在金屬襯底上合成GO的示意圖；

(b) GO包覆基底表面的拉曼圖譜；

(c) 石墨烯包覆純不鏽鋼基底的XPS分析；

(d) XPS的C1s反褶積圖譜。

為了模擬家庭和醫院的細菌感染情況，研究者們在GO金屬上培養細菌細胞，然後提供營養豐富的培養基促進其增長；第二天，以菌落細胞的生長形式作為抗菌活性的量度，在GO金屬片上沒有觀察到任何菌落，除鋅以外的純金屬沒有觀察到抑制細菌生長。而控制GO玻璃的表面顯示出豐富的細胞生長（圖2a）。這些結果表明，與純金屬板相比，包覆金屬的GO片具有優異的抗菌活性。這可以通過GO和底物的相加效應來解釋，它們共同增強了金屬的抑菌/殺菌作用。研究者們在這裡提出，由於細菌細胞的相互作用，在GO表面的含氧官能團可以接受來自細胞壁的電子並且產生活性氧簇（ROS）。在GO塗層金屬(GO-M)表面繁殖，由於細胞壁與底物之間的電子傳遞會損害細菌細胞的活力，然後倒入瓊脂，把細胞分散到石板上，並在一夜之間繁殖。在接觸初期產生的活性氧可以通過瓊脂擴散，導致後來檢測到的板上生長抑制。在鋅存在條件下觀察到的生長抑制作用可以用類似的機制來解釋。

圖二 生長抑制試驗

(a) GO包覆玻璃基地表面顯示出豐富的細菌生長，說明其沒有抗菌活性；

(b-e) 進行鑑定後在GO包覆塗層金屬板上沒有可見的菌落。

雖然菌落計數是預測細菌細胞生長的一種經典方法，但有時對細菌而言是可行的，但不能形成菌落，它們處於休眠狀態，在適當的條件下，它們可以再生，甚至表現出致病性。在這種情況下，利用細胞染色技術分別用Syto 9染色和碘化丙酸(Pi)染色活細胞和死細胞，可以準確區分健康細胞和受損細胞。Syto 9既能染活細胞，也能染死細胞，而Pi只能染紅死細胞。為了確定GO包被材料對細菌定植的抑制能力，採用活死成象試劑盒對大腸桿菌進行染色。得到與先前相一致的結果，在GO-Ni和GO-Zn上通過Pi染色檢測到更多的死亡細胞；在GO鋼和GO-Sn上觀察到的死亡細胞數量相對較少；GO玻璃主要顯示標記為綠色的Syto 9，為活的細胞。因此，研究者們可以在此提出，天然衍生的GO塗層金屬板通過誘導膜損傷，對大腸桿菌細胞起著強大的殺菌平臺的作用。這可能部分由於細菌壁的擾動的細胞膜的完整性，其中研究者們提出了電子的轉移。結果表明GO鋅和GO鎳相對於GO錫和GO鋼基體具有更高的殺菌活性。在之前的實驗中，去玻璃系統並沒有表現出任何的殺菌作用。作為比較，研究者們也利用大腸桿菌細胞暴露於純蟲膠衍生去染色（S）和沒有任何襯底商業GO（C）。我們在兩個GO（S）和GO（C）觀察到了一些死細胞和大部分活細胞。

圖三 活/死細胞圖片

(a) GO玻璃上大多數細胞可以存活；

(b,c) GO鋼板和GO-Sn相比於GO-Ni和GO-Zn具有更高的活細胞生存率；

(d,e) GO-Ni和GO-Zn上大多數細胞死亡。

為了更好地理解自然的抗菌塗層材料，研究者們表徵了掃描電子顯微鏡（SEM）和場發射掃描電鏡（FESEM）。選擇直接接觸各種基質時觀察到細胞膜損傷的形態，研究者們可以看到，大腸桿菌細胞在GO-Zn樣品板上遭受最嚴重的損傷並且細胞形態完全喪失，導致細胞膜損傷大面積爆發。GO-Ni上的細胞表現出與GO-Zn膜損傷相似的作用，導致細胞形態的改變。相對而言，在GO-Sn上仍有較多的完整細胞，但細胞膜的損傷和細胞形態的喪失是相當明顯的。正如研究者們所預料的，許多完整的細胞在GO鋼上有明顯的膜穿孔，相比之下，對照表面玻璃表面的細胞形態基本正常且外觀健康。

圖四 不同GO包覆基底樣品的FESEM表徵

(a) GO玻璃上的細胞生長健康且細胞膜無損傷；

(b-e) 細胞在其餘基底上繁殖顯示出不同的細胞形態，可以觀察不同細胞膜破壞程度。

金屬與環境接觸產生活性氧簇（ROS），為了鑑定由與GO金屬和GO-玻璃系統相互作用產生的細胞內活性氧簇ROS產生，採用螢光顯微法進行ROS檢測分析。通過一種細胞內ROS指示劑——2』，7』-二氯螢光素-二乙酸酯(DCFH-DA，10μM)進行測試。通過將非螢光的DCFH氧化成高度螢光的2』，7』-二氯螢光素(DCF)來進行ROS產生的定量分析。研究者們可以看到由細菌與不同塗覆材料相互作用產生的細胞內會有ROS產生量的變化。當細胞暴露於GO-Sn、GO-Ni和GO-Zn等基底時觀察到螢光DCF細胞指示ROS產生的；相反，在GO-鋼和GO-玻璃表面上不存在ROS產生。綜上所述，檢測細胞在不同的基板上繁殖1小時，ROS在GO鋼相對GO-Zn、GO-Ni誘導培養的持續時間較長，且殺菌活性不太有效。

圖五 活性氧簇ROS產生分析

(a) 上在25℃繁殖1小時後，大腸桿菌細胞在經GO包覆表面的測試和對照(GO-玻璃)，然後用ROS指示劑DCFH-DA染料染色15分鐘。I，II)在接種在GO-玻璃和GO-STEEL系統上的細胞中未發現ROS產生，如不存在螢光DCF細胞。與ROS產生相關的III-V)螢光DCF細胞有序排列，GO-Zn＞GO-Ni＞GO-Sn；

(b,c) 觀察到的細胞中與ROS產生相關的細胞中觀察到用於(B)、GO-金屬系統和(C)的活性的所提出的分子機制。

b-i)從呼吸鏈上獲得電子轉移的細菌細胞壁的平面示意圖。b-ii)在金屬基底上獲得的細菌細胞壁的平面示意圖，導電GO-金屬體系可誘導ROS產生。c-i)在玻璃基底上獲得功能性呼吸途徑的細菌細胞壁的擴張視圖｡c-ii)在玻璃基底上獲得的細菌細胞壁的擴張視圖，不導電的GO-玻璃系統不能從細菌壁上提取電子並且不能誘導ROS產生｡

【 結論 】

本文是第一個研究分析了自然衍生的GO對各種金屬基板能夠產生優異的抗菌性能。研究者們首次提出的蟲膠衍生GO金屬系統對革蘭氏陰性菌大腸桿菌殺菌作用的分子機制。研究結果有力地表明，GO作為一個電子泵，從細胞膜上的電荷轉移到GO表面上的官能團氧，導致ROS產生。在第一步驟中，電子轉移會破壞膜的完整性和細胞活力；其次，ROS介導的氧化應激損害了細菌的代謝和膜結構，最終導致細胞死亡。因此，研究者們可以得出結論，蟲膠衍生的GO金屬通過非氧化和ROS介導的氧化應激機制對細菌細胞發揮作用。因其成本低、易得、附著力強等優點製備以蟲膠為基礎的抗菌底物，在各個行業有著廣泛的應用前景。本工作將促進蟲膠衍生GO於各種底物上的進一步的基礎和應用研究。

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供稿丨深圳市清新電源研究院

部門丨媒體信息中心科技情報部

撰稿人丨簡奈

主編丨張哲旭

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