韓春雨團隊和他們的NgAgo-gDNA技術自第一次被報導，就一直倍受關注，近日，方舟子公開發文質疑韓春雨「諾獎級」實驗成果的可重複性問題《方舟子發文質疑韓春雨「諾獎級」實驗成果，你怎麼看？》【本公號昨天的文章】，而對於方舟子和部分網友的質疑，韓春雨也於7月2日在百度貼吧上做出了回應。韓老師特別強調細胞系統的正宗無汙染，國內的很多細胞株被支原體汙染，要特別當心。我們特別調查，目前韓老師實驗室使用的是Clarkbio的血清，批號JC50166，這下子clark血清要火了，趕緊搶貨吧！
以下是回複方舟子的內容：
早前，韓春雨一經報導，就有細心的人在貼吧上找出了韓老師。（郵箱已暴露了身份）
而此次韓春雨老師的回覆是其在「國際米蘭吧」上的回帖。網友「第十三米的陽光」引用方舟子的文章《河北科技大學韓春雨「諾貝爾獎級」實驗的重複性問題》中的內容在該貼吧內發帖。（http://tieba.baidu.com/p/4645810480?pid=93027569268&cid=0&from=prin#93027569268）
韓春雨老師用自己的「槐北路「的帳號進行了回復
對於方舟子和網友們提出的質疑，韓春雨在該回復裡進行了詳解解答：
質疑1.：圖片3：有人能重複（FACS和Western Blot），但那有可能是假陽性。
韓春雨的回覆：細胞做好檢測，不要有寄生菌汙染，不要有支原體汙染（Ago系統對汙染特別敏感---特別是單轉guide假陽性---我非常確定在沒有汙染的情況下，單轉guid不會影響GFP表達，假陰性也大多因為細胞汙染，假陽性和假陰性我都遇到過，國內買的細胞我就不吐槽了），轉染用的質粒質量要好（可用30ngGFP轉細胞，若是均一且效率高表明質量好，強弱不均一則表明質量差，越不均一表明質量越差），guide磷酸化完全（沒有磷酸化不能load和切割---謝謝印證我的Fig2結果，至於怎麼檢測，自己跑個PAGE看看---）
質疑2. 目前還未見有人反映重複出了圖4結果。
韓春雨的回覆：Fig4，也是幾乎惟一算是有難度的，就是控制轉染時的細胞密度和用血清控制細胞生長，時間稍長，畢竟NgAgo未經過系統的密碼子優化---照著online method上protocol for genome editing and T7E1做（小經驗，PCR最好不要有引物二聚體，如果引物二聚體多請重設引物；PCR產物直接回收最好不跑膠回收，可能跟ago切24bp有關，設好對照！）---銀染解析度高，可以排除T7E1假陽性，能做出預期條帶後請用PCR產物去測序。歡迎大家廣泛使用此系統，並分享成功經驗和失敗教訓。附，addgen上的質粒，可以直接用作基因組編輯。再次強調，不加NgAgo，就能抑制GFP，是假陽性，是細胞出問題了（謝天謝地不但我自己而且審稿人也有這個對照）出現假陽性的細胞切基因組就沒戲了。對於Fig4，若是不習慣做銀染，也可以直接做KI：doner 用GFPcoden+polyA signal，前後加幾個保護性的鹼基---從GFP-N1擴出來連到T-vector上，再從此doner-Tvector上擴（防止GFP-N1汙染的假陽性）出來純化，500-800ng共轉（for each well of 24 well plate）。
而對於韓春雨的回覆，方舟子也做出了回應：
那麼這種「高超的實驗技術「究竟是不是實驗細節的處理，不同網友也有自己的看法，有網友表示pcr已經有那麼久的歷史，且機器已經半自動化，但目前也不是每個人次次都能成功。在實驗過程中，技術不難，難的是整個實驗過程都不能有半點差錯。關鍵一步都沒處理好，所以做不出來，但是恰恰是關鍵的一步 這也是他能做出來成果，別人做不出的原因。
韓春雨老師也強調了無汙染的細胞重要性。
而對於目前大家較為關注的重複性問題，目前網上雖然有一些表示沒有重複出來，一方面韓春雨老師經過幾年發表出來的結果，而目前大部分實驗室也只剛剛嘗試幾個月，另一方面一些網友認為目前重複不出來的原因也可能是在這個風口浪尖，為避免惹禍上身，重複出來的人也未必想站出來發聲。而且也有網友爆料來自印度的學者Dr. Debojyoti Chakraborty發言已重複出韓春雨NgAgo實驗。
Hi guys，
We have used this system and it works. We have followed the same protocol as mentioned in the paper and were able to confirm knockout both on FACS as well as western. We purified the oligos on gel after T4 PNK and saw the phenotype after 48 and 72 h.
cheers
debo
並且詳細分享了他們的protocol：
Here's the protocol we followed：
We first phosphorylated the gDNA using the PNK kit from Ambion for 1 hr followed by heat inactivation at 95 degrees for 5 min. We then went on to transfect 100，000 cells in 12 well plates as follows：
Mix 1：
Lipo reagent- 3ul
Optimem- 43ul
EGFP N1- 1 ug
NgAgo- 900 ng
gDNA- 500 ng
Mix 2：
Lipo 3000- 2ul
Optimem- 48ul
Mix 3：
Media- 250ul
Optimem- 150ul
Mix1 and Mix2 was incubated for 10min each and then both were mixed together and incubated at RT for 30min
This was now added to cells. To each well， 50 ul of Mix 3 was added on top. No further media was added to the cells.
After 12h， the mix was removed and fresh media was added.
科研成果的權威性是在質疑聲中建立起來的，而影響力越深遠、意義越重大的成果，受到的質疑就越多。最前沿領域的科研成果的鑑別通常異常困難，難以證明，也難以證偽。而檢驗一項新技術需要時間和客觀標準，實驗肯定有關鍵細節，韓春雨本人也不迴避系統的不穩定性，也表示希望與同行進行交流，且目前在努力改進，即將推出2.0版和smart版，讓我們拭目以待吧。
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【1】細胞培養過程中別讓培養基太激動！
【2】生物實驗室120種有毒物質
【3】人造皮膚表面可以生長毛髮與汗腺
【4】Real-Time PCR，一篇就足夠！
【5】說起來都是淚的細胞培養！
【6】細胞鋪板：怎樣才能鋪得均勻？
【7】友誼的小船說翻就翻----科研版
【8】如何高效讀文獻？Science主編和9位大咖學霸來教你
【9】我為什麼不買gibco血清？
【10】不想走科研彎路？這些經驗你得知道
【11】不要跟我說你了解蛋白Marker
【12】不能讓總理操心我們的細胞培養
【13】只有學生物的才能看懂的笑話
【14】【3篇Nature、1篇Cell】重大突破！CRISPR再現「魔剪」實力，這次只「剪」單個鹼基
【15】98%的人被催眠，驚的我呆了個去了！5道題我全被催眠了！！
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