2016年8月8日，韓春雨向非盈利性質粒共享信息庫 Addgene 提交了其 NgAgo 技術的新版詳細實驗方法。同時，一項已有近200名科研人員參與的在線調查顯示，目前有 9 人聲稱在實驗中觀察到 NgAgo 的基因編輯效果。科研圈對比分析了韓春雨新公開的實驗細節，並對相關事件進行簡要解讀。
整理 趙維傑 張帥琰 吳蘭
三個月前，河北科技大學副教授韓春雨在《自然-生物技術》上發表了 NgAgo 酶對哺乳動物進行基因編輯的論文（F. Gao et al. Nature Biotechnol. 34, 768–773; 2016）。文章介紹了一種新型的基因編輯方法，迅速引起廣泛關注。
然而，隨著時間推移，研究的可重複性問題為韓春雨團隊招致諸多質疑。8月2日，《自然-生物技術》宣布將按照既定流程對研究進行調查。8月8日，韓春雨向質粒共享信息庫 Addgene 提交新版的詳細實驗方法，其中補充了數項應特別注意的問題。
（新版實驗方法全文，可至 https://www.addgene.org/static/data/plasmids/78/78253/78253-attachment_OG34WIqLRecj.docx 下載）。
新版實驗方法具體分為細胞培養、質粒/gDNA 共轉染，以及基因組提取三個部分。對比《自然-生物技術》上 NgAgo 論文 Supplementary Information 中描述的 methods（詳見 http://www.nature.com/nbt/journal/v34/n7/full/nbt.3547.html#supplementary-information），新實驗步驟有幾處改變：
1 血清品牌由 Hyclone 變更為 Gibco 。
2 增加了關於「293T 細胞貼壁不牢，換液時要小心操作」的小提示。
3 建議在質粒/gDNA共轉染的8小時、12小時或24小時後，補轉一次 gDNA；舊版方法中只提及了「24小時」。
4 舊版方法中，溶解和稀釋質粒及 gDNA 的緩衝液為含有 EDTA 的0.5xTE（5 mM Tris-HCl, 0.5 mM EDTA, pH 8.0），而新方法中則變更為水（pH 8.0）。
最後一處緩衝液配方的改變尤其引人注意——在韓春雨補充在實驗步驟之後的四條注意事項中，EDTA 再次出現：其中一條注意事項專門提到，應該避免向 NgAgo/gDNA 系統中加入 EDTA。這四條注意事項分別是：
1 NgAgo/gDNA 系統對細胞中胞內菌和支原體感染敏感，在實驗前要仔細確認所使用的細胞株未被汙染或汙染已被徹底清除。
2 由於 NgAgo/gDNA 系統需要鎂離子，在細胞消化和培養過程中要避免使用金屬離子螯合劑 EDTA。也可以在培養基中額外加入 5 mM或其他濃度的鎂離子。
3 轉染試劑 Lipofectamine® 3000會阻礙 gDNA 進入細胞，不能用於轉染。可以使用轉染試劑 Lipofectamine® 2000。其他轉染試劑是否可用還有待驗證。
4 建議使用 T4 PNK (Biolab) 對 gDNA 進行5』端磷酸化處理，處理體系如下：（體系略）處理後的 gDNA 無需再次純化，直接用水（pH 8.0）稀釋至300 μl，終濃度10 nM。
據 Nature 報導，韓春雨近來每天都會收到很多騷擾電話和簡訊，但他始終堅信自己的研究成果沒有問題。Nature 將喜愛茶葉、古琴，並且從未出國的韓春雨稱為「隱士」，而今這位隱士不得不走上風口浪尖，直面質疑。 據新華網消息，河北科技大學將要求韓春雨在一個月內重複實驗，並邀第三方證實。
為什麼 NgAgo 會「不好使」？
NgAgo 之所以引起廣泛關注，在於其作為基因編輯工具顯現出的一些令人激動的新特性，賦予了其可觀的應用潛力。例如，NgAgo 系統沒有 PAM 序列依賴性，與 CRISPR 系統只能識別附近有 PAM 序列的靶點相比，NgAgo 理論上可切割的序列更多。其次，NgAgo 系統用以識別靶基因的先導物為 DNA（gDNA），與 CRISPR 使用的 gRNA 相比，易用性更強，成本更低。另外，NgAgo 系統可以作用於很難被 CRISPR 切割的 GC 富集區域。
與此同時，NgAgo 系統也表現出一些劣勢。NgAgo 系統使用 5』 端磷酸化 gDNA ，這種先導物無法從質粒裡表達獲得，不能在靶細胞裡產生，只能在細胞外合成後輸入細胞內；研究者在執行基因編輯時，可能還需要持續向細胞內補充 gDNA。並且，gDNA 只能與新生的未成熟 NgAgo 蛋白結合形成複合物。
愛丁堡大學 MRC 再生醫學中心的博士後 Pooran Dewari 專門研究基因編輯系統的優化，他表示，NgAgo 系統的目前的可重複性難題，無疑說明了這一系統的優化工作非常困難；他同時認為，NgAgo 系統難以優化的原因，可能就包括 s' 端磷酸化後的 gDNA 在哺乳細胞中不能穩定持續存在，以及 NgAgo 蛋白無法在成熟狀態下與 gDNA 形成複合物。
已有9人聲稱 NgAgo 有效
自韓春雨2016年3月在線發表論文後，來自全世界的科研人員共發出將近400次獲取 NgAgo 質粒的請求。Pooran Dewari 面向正在重複 NgAgo 的科研人員發起了一項調查。調查發現，截至2016年8月8日，193名被調者中，各有9人聲稱在應用 NgAgo 系統後觀察到了基因剪切或插入跡象（indels and knock-in），100人聲稱無法觀察到剪切，47人聲稱無法觀察到基因插入。
（調查全部內容見連結 ：
http://blog.addgene.org/google-forums-round-up-first-impressions-of-ngago，不過需要翻牆；後臺回復 NgAgo，可獲取調查最新結果完整截圖）
然而，調查還顯示，大部分被調者仍未對 NgAgo 喪失耐心，其中66%的被調者表示會等待他人對這一系統的優化結果，10%的被調者表示會自己優化 NgAgo，24%的人表示將繼續使用 CRISPR。
附：NgAgo 可重複性問題事件節點
· 2016年6月，網絡上逐步有傳言稱，國內外有多家實驗室重複不出韓春雨論文的實驗結果，引起部分科學家的質疑。韓春雨在回覆中表示，新系統剛出來都會「不好使」，他也認同目前 NgAgo 系統不夠穩定，等2.0版本出來會找專門機構免費發放。
· 7月2日，方舟子公開質疑該實驗的可重複性，NgAgo 研究可重複性問題自此規模化發酵，韓春雨也立刻進行了實驗方法上的回應，稱實驗重複失敗可能是由於支原體汙染、試劑保存等問題。
· 7月28日，先前聲稱 NgAgo 有效的澳大利亞遺傳學家 Gaetan Burgio 在 Twitter 上表示，經進一步檢測，該技術無法進行基因編輯。他表示，NgAgo 也許會奏效，但鑑於其不穩定性，它並沒有 CRISPR 實用。
· 7月29日，西班牙遺傳學家 Lluís Montoliu 向國際轉基因技術協會 （ISTT） 的同僚群發郵件，建議「放棄所有NgAgo相關項目」。與此同時，之前聲稱 NgAgo 有效的印度分子生物學家 Debojyoti Chakraborty 及德國癌症研究中心的遺傳學博士生 Jan Winter 也都表示先前結論有誤；Jan Winter 同時表示，自己並不認可韓春雨此前做出的回應。
· 截至8月8日，愛丁堡大學 MRC 再生醫學中心的博士後 Pooran Dewari 發起的一項針對 NgAgo 研究可重複性的線上調研已經收到近 200 位研究者的回覆，其中各有9人聲稱在應用 NgAgo 系統後觀察到了基因剪切或插入跡象（indels and knock-in），100人聲稱無法觀察到剪切，47人聲稱無法觀察到基因插入。
· 據新華網消息，河北科技大學將要求韓春雨在一個月內重複實驗，並邀第三方證實。
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