文 | 陽光德美
ADC（Antibody drug conjugate）是將單克隆抗體通過偶聯臂（linker）與小分子藥物共價偶聯形成的複合物。ADC藥物分子包含抗體、linker、小分子藥物三個結構模塊。典型的ADC分子結構示意圖如圖1所示。
圖1 ADC分子結構示意圖 [來源維基百科]
20世紀初德國諾貝爾獎得主Paul Ehrlich最早提出ADC藥物的構思。1958年Mathe首次將抗鼠白細胞免疫球蛋白與甲氨蝶呤偶聯用於白血病的治療，拉開了抗體偶聯藥物的研究序幕。受限於當時的抗體製備技術，鼠來源的抗體偶聯藥物並沒有在臨床上取得成功，1975年雜交瘤技術的誕生才催生出第一個為人所熟知的ADC分子。之後，靶標抗原的選擇、抗體人源化技術、超高細胞毒性小分子藥物、抗體藥物荷載等問題隨著彼時的技術進步被一個個解決。
2000年FDA批准了第一個ADC藥物Gemtuzumab ozogamicin（商品名Mylotarg），但上市後監測發現Mylotarg療效不佳，副作用明顯，患者用藥風險大於獲益。因為市場表現慘澹，Mylotarg在2010年黯然撤市。2013年Kadcyla成為第二個獲批的ADC藥物。Kadcyla是Genentech在明星產品Herceptin基礎上開發出來的一款ADC，伴隨著Kadcyla的開發，國內也成立了一批ADC創業公司，包括榮昌生物（2008），東曜藥業（2009），特瑞思（2010），杭州多禧（2012）等，這些早期創業公司目前已經成為了國內ADC藥物研發的中堅力量。Wyeth在2017年將調整劑量後的Mylotarg再次推向市場，同年又成功推出了Besponsa。ADC藥物在2019年真正迎來爆發，2019年至今已經批准了5款ADC。
圖2 ADC藥物發展簡史[The Royal Society of Chemistry, 2019]
ADC藥物批准的3個階段也真實地反應了ADC藥物研發的3個歷程。ADC藥物的技術平臺也在這3個歷程中逐步進步。根據各個階段ADC的技術特點，業內把ADC分為三代。以Mylotarg為代表的第一代ADC，以Adcetris和Kadcyla為代表的第二代ADC，以Besponsa 、Padcev、Enhertu等為代表的第三代ADC。
表1 不同時期ADC藥物技術特點
目前已經有9款ADC藥物獲FDA批准上市，中國NMPA也已經批准了2款ADC藥物（Kadcyla和Adcetris）。2020年8月，榮昌生物的緯迪西妥單抗（RC48）提交上市申請並被納入優先評審，如獲批將成為第一個上市的國產ADC藥物。
表2 已經獲批的ADC藥物
註：數據來源於antibody society網站及[The AAPS Journal, 2020]
ADC藥物開發的關鍵要素
靶點、抗體、效應分子（payload）、linker、DAR值（DAR，drug-to-antibody ratio，抗體上所結合藥物分子的個數即藥物-抗體比），這5個方面是ADC藥物開發需要關注的重點，也是ADC藥物開發的關鍵要素。其中DAR值主要由linker及標記技術決定。
圖3 ADC開發結構要素示意圖[Polymers for Advanced Technologies, 2020]
1. 靶點
已經獲批上市的9個ADC藥物共涉及8個靶點，其中CD22，CD30，CD33，CD79b，BCMA等5個靶點的適應症為血液瘤：HER2，Nectin-4，Trop-2這3個靶點的適應症為實體瘤，其中HER2靶點已有兩個獲批上市的產品。2019年以前獲批的4個ADC藥物僅Kadcyla為實體瘤適應症，而2019年以後獲批的5個ADC藥物中有3個為實體瘤適應症。
不難發現，ADC藥物研發的熱點已經從血液瘤轉移到實體瘤。尋找能夠合適的藥物靶點已經成為ADC研發企業爭奪的熱點。由於ADC藥物的藥效作用主要依靠小分子藥物，而靶點只作為標誌物，只要能招募ADC分子即可，至於靶點是否有生物學效應並不十分重要，因此相對於單克隆抗體而言，ADC藥物的靶點選擇更多。潛在的靶點或是在腫瘤表面過表達，或是在腫瘤微環境中廣泛分布。
圖4 ADC可開發的實體瘤抗原靶點[British Journal of Cancer, 2016]
2. 抗體
由於抗體靶點特異性高、半衰期長等使其被作為理想的細胞毒藥物運送載體，理想的抗體需滿足與靶點具有較高的親和力，通常Kd 0.1~1 nM，血中穩定性好，免疫原性低以及較低的交叉反應。IgG更易被腫瘤細胞攝取，常被用作ADC的抗體部分。作為ADC藥物的導航系統，抗體主要負責將小分子藥物帶到靶細胞發揮作用，抗體本身的藥效作用並不十分重要。ADC的抗體部分雖然在介導內吞和抗體本身的治療作用等方面與單純的抗體藥物有所區別，但整體上抗體選擇及開發策略與單純的抗體藥物沒有太大差別。
3. 效應分子（Payload，同負載/細胞毒藥物/小分子藥物）
效應分子的作用機制決定ADC的藥效的發揮和毒性的產生。目前，常用的細胞毒性藥物效應分子為微管抑制劑（如：auristatins、maytansinoids）、DNA損傷劑（如calicheamicin、duocarmycins、anthracyclines、pyrrolobenzodiazepine dimers）和DNA轉錄抑制劑（Amatoxin和Quinoline alkaloid (SN-38)）。已經獲批上市的9個ADC藥物共使用了6個不同的小分子藥物，其中有3個ADC藥物使用MMAE作為偶聯藥物，2個藥物使用Calicheamicin作為偶聯藥物，另外成功應用的還有MMAF，DM1，SN-38，Dxd。應用較多的小分子藥物結果如表4所示。
目前獲批的ADC大都採用利用異質化連接技術，即基於胺的賴氨酸結合（amine-based lysine conjugation）和基於巰基的半胱氨酸結合（thiol-based cysteine conjugation）。每個抗體具有多個Lys/Cys位點，所以將小分子藥物與抗體結合得到的ADCs是含有不同DAR值（0-8）的多種成分的混合物。體外的藥效是隨著DAR的增加而增加，但在體內ADC藥效不隨DAR值增高而增加，可能由於疏水性的小分子藥物或/和linker的增加到一定程度後，會導致ADC在水相環境中非特異的疏水相互作用和清除率的增加，實際可能是DAR值越高毒性越高，TI越低。目前，利用位點特異性（site-specific, homogeneous conjugation chemistries）的結合方法可以有效地控制DAR值，獲得ADC穩定性和聚集性均較佳，如同質（homogeneous）DAR值為2的ADC比隨機結合方法得到平均DAR值為3.4-4的ADC的疏水性和聚集效應均低，但TI可能有限（如PBD和Aur0101）。
表4 ADC藥物目前研究較多的小分子藥物列表
4. 偶聯臂（Linker）
Linker是通過共價結合作用將單抗和小分子藥物部分連接起來，linker在血流中的穩定性非常重要，一般linker比ADC的半衰期大10倍為好。理想的linker需在循環系統中具有足夠的穩定性以降低脫靶引起的毒性反應，並且一旦被內化至靶組織即可釋放效應分子。雖然只起到連接作用，但linker的偶聯方式決定了ADC藥物的很多重要屬性，如DAR值分布、治療指數（therapeuticindex，TI）、PK/PD等。linker和結合位點的選擇關乎ADC的穩定性，考慮到小分子藥物一般為疏水性，為方便連接，linker需要具有一定的疏水性。根據linker在細胞內是否被裂解分為兩大類：裂解型（cleavable linker）和穩定型（non-cleavable linker），不同偶聯linker的優缺點如表5所示。
表5 不同偶聯linker的優缺點 [Protein Cell, 2018]
藥代動力學研究進展
複雜的結構組成和作用機制使ADC的藥代研究更具挑戰。ADC給藥方式主要為靜脈給藥，藥物進入體內後，可通過特異和非特異途徑進入細胞。特異途徑為與細胞表面的受體結合，通過內吞作用內化到達細胞，經內吞小體進入溶酶體，溶酶體的酸性環境和蛋白水解酶會致使ADC降解，釋放的效應分子隨後進入細胞質中，然後通過DNA插入或抑制微管合成等方式誘導細胞凋亡；還可通過非特異性的胞飲作用進入細胞，這種方式可能會導致ADC在非靶細胞中釋放效應分子，從而引起不必要的毒副作用。另外，ADC還可以通過「旁觀效應（bystand effects）」發揮殺傷作用，即裂解或釋放的細胞毒性藥物可以進入鄰近細胞，發揮殺傷作用，當然也因此會產生耐藥性。
圖5 ADCs的體內過程及其腫瘤免疫機制示意圖[BioDrugs, 2018]
ADC的主體為抗體（~98%），除了具有抗體的藥代動力學特徵，又因為結合了效應分子，使其呈現出獨特的PK特徵。該部分主要介紹ADC PK的影響因素、PK特徵和動力學模型。
1. PK的影響因素
ADC進入體內後，效應分子可通過酶解或化學反應從主體結構上逐漸解離，得到總抗體（Total antibody，Tab）、結合型抗體（ADC）和游離的效應分子（unconjugated drug）（如圖6所示），它們在體內濃度的變化對解讀ADC的藥代特點至關重要。總抗體為結合的抗體和裸抗（DAR=0）的總和；結合型抗體為抗體至少結合一個效應分子，是ADC的原型藥；游離的效應分子為ADC裂解或被分解代謝後形成的游離效應分子和/或保留效應分子結構的連有胺基酸殘基和/或linker的效應分子代謝物，是ADC毒性評價的物質基礎。與靶點結合的特異性、linker的穩定性、新型效應分子的應用等研究是研發ADC藥物成敗的關鍵，通過優化ADC的結構，提高其PK特性，可以更好的闡明劑量-效應關係，從而進行安全性和有效性評價。
圖6 ADC藥物處置方式[The AAPS Journal, 2020]
1.1 結構
1.1.1 抗體
抗體結構本身、親和力、特異性、FcRn結合能力以及Fcγ介導的抗體的Fc效應功能（如ADCC或CDC)等都會影響ADC的PK。ADC效應器功能對藥效和毒性作用的影響還不清楚。儘管Fc可以增強ADC殺傷腫瘤的作用，但Fcγ受體卻是引起脫靶和劑量限制性毒性的主要原因。目前，已有缺失效應功能的IgG4型抗體的ADC批准上市（Mylotarg和Besponsa）。抗體特異性高可避免產生毒性，缺乏特異性的抗體會在到達腫瘤組織前被循環系統消除。
1.1.2 效應分子
效應分子的引入會使ADC聚集，理化性質不穩定，不僅是由於其數量和疏水作用增加使得ADC疏水性的顯著增加而不穩定，還由於這種結合作用會引起抗體二級結構和三級結構的變化使得構象的穩定性降低。同時，效應分子的透膜性、代謝、是否為P-gp的底物對於bystander efferts和誘發耐藥性均非常重要。效應分子結合位點的差異會對ADC的PK會有一定的影響。反之，受抗體部分的影響，釋放的效應分子被賦予了較長的半衰期，並且其清除速率會受到ADC的清除率及釋放效應分子速率的影響。
不同DAR值的ADC具有不同的PK特徵，DAR值會影響ADC在循環中的穩定性，DAR值越高穩定性越差（如圖7所示）。通常，DAR值大於4會導致較差的PK特性，隨著DAR值的增加，不但藥物的清除率隨之增加、半衰期逐漸降低，還會引起藥物聚集，可能產生較高的毒性，理想的DAR值為3-4。ADC進入體內會伴隨著效應分子的釋放，平均DAR值會隨時間而降低直至降為零，DAR的變化速率可以反映效應分子從抗體上逐漸解離下來的速率。與此同時，循環系統中效應分子的量隨之升高，進而影響療效和安全性。有研究發現，DAR增加可能不會改變裸抗在肝臟的吸收。
圖7 DAR值與抗腫瘤作用及清除率的關係[The AAPS Journal, 2020]
儘管循環中的效應分子通常遠低於ADC的濃度，但是由於效應分子的細胞毒性和窄的TI會影響ADC的安全性和有效性，使得其在高變異患者中的暴露研究尤為重要。此外，如果效應分子為外排轉運體的底物（如MMAE、DM1、calicheamicin為P-gp底物），ADC的細胞毒作用會因為的外排作用而減弱，因此產生耐藥。
1.1.3 偶聯臂（linker）
Linker在血流中的穩定性非常重要，通常linker的半衰期比ADC大10倍為好。不同類型linker的ADC內化後會以解離和分解代謝的方式通過靶點介導或非特異途徑釋放效應分子，這個過程可以發生在細胞內和/或體循環中。裂解型linker的ADC可以通過linker的裂解產生游離效應分子，而穩定型linker的ADC則通過蛋白酶降解的方式生成活性代謝產物。而且，不同的linker類型的ADC產生代謝產物的結構也不同，裂解型linker ADC可釋放完整效應分子，穩定型linker ADC則是釋放連接胺基酸的效應分子。有的代謝產物也會增強抗腫瘤活性。
裂解型linker對細胞內環境敏感，在細胞內通過分解代謝和解離共同作用釋放出遊離的效應分子和抗體。代表linker如酸裂解linker通常在血液中穩定，但在pH低的溶酶體環境中會快速裂解（如Besponsa和Mylotarg）；溶酶體蛋白酶裂解linker（如：BV、PV和EV）在血中穩定，但在富含蛋白酶的溶酶體中不穩定，會釋放效應分子；二硫化物linker通過胞內穀胱甘肽的還原作用釋放效應分子。裂解型linker可以進一步分為resitual和traceless，前者效應分子連有linker，後者則不與linker相連。此外，如果效應分子可以跨膜，則可通過發揮潛在的bystand effects作用消滅腫瘤（如圖8所示）。該作用通常由效應分子（如monomethyl auristatin MMAE）和linker的化學結構所決定。通常，利用ADC的bystand effects治療實體瘤，是否可以用於血液腫瘤的治療還不得而知。
圖8 ADC無(a) 和有(b) bystander effect 時的作用機制示意圖[Current Drug Delivery, 2020]
穩定型linker由抗蛋白酶降解的穩定結構構成，在血中穩定，代表linker如硫醚和maleimidocaproyl（MC）。該類型的ADC在胞外不會釋放效應分子，在胞內，抗體部分才會經溶酶體蛋白酶分解代謝釋放含有胺基酸殘基和/或linker的效應分子（linker-payload形式）和抗體片段。穩定型linker的優勢是其擁有良好的穩定性，可降低脫靶帶來的毒性，但缺點是效應分子釋放效率相對裂解型linker低。此外，由於藥物會通過賴氨酸或半胱氨酸在腫瘤細胞表面聚集，使得該類型linker的ADC未見bystand effects。
一般說來，穩定型linker的ADC較裂解型的ADC的半衰期長、清除率低。有研究表明，二硫化物linker的ADC在體內的清除率較硫醚linker高；而兩者總抗體的清除率相當。蛋白酶作為linker的ADC，在體內無論是結合型ADC的清除率，還是總抗體的清除率，都比二硫化物linker的高。此外，含有負電荷的磺酸基、焦磷酸二酯或者聚乙二醇的親水性linker可有效降低蛋白的聚集，降低免疫原性，還可能會增加ADC的暴露、改變其分布。
1.2 藥物藥物相互作用
目前，臨床上使用的ADC藥物適應症主要為癌症，患者通常同時服用多種藥物，並且藥物可能會對免疫系統和器官（如肝、腎）造成損傷，同時，效應分子大都為細胞毒藥物，所以，ADC的DDI評價無論是在臨床前開發階段還是在臨床階段均尤為重要。
ADC的抗體部分和效應分子的DDI均需要探究。抗體部分的DDI可依據抗體與促炎性因子相關研究進行評估，DDI研究則更多關注效應分子。而作為效應分子的細胞毒藥物體外抑制常數Ki值在微摩數量級範圍，這高於循環中的細胞毒藥物暴露濃度幾個log數量級，很難作為「施害藥（perpetrator）」引起DDI。即便如此，由於細胞毒藥物臨床上的TI較窄，其作為「受害藥物（victim）」需要仔細評估其對患者安全性和有效性的影響。
從目前來看，已上市ADC藥物存在臨床DDI的可能性較小。如Adcetris，效應分子MMAE為CYP3A4的底物，研究表明，存在潛在的DDI，但由於MMAE暴露水平極低，不足以影響療效和安全性，所以在與CYP3A4的抑制劑和誘導劑聯合使用時無需進行劑量的調整。Enhertu的臨床DDI研究結果表明其與CYP3A和OATP抑制劑聯用也不會產生具有臨床意義的DDI。只有TRODELVY，與UGT1A1的抑制劑/誘導劑聯合使用時會改變效應分子SN-38的系統暴露，可能影響安全性和有效性，使用說明書中要求避免與UGT1A1的抑制劑或誘導劑聯合使用。此外，群體藥代模型（Population PK，PopPK）是研究單抗DDI的一個有利工具，如根據PopP分析表明Polivy臨床DDI發生的可能性較低。
1.3 免疫原性
ADC的免疫原性可以由抗體部分引起，也可以由效應分子或產生的新的表位所引起。疏水性連接基團和疏水性效應分子通常會促進ADC的聚集，引起免疫原性。雖然ADC為人源化或者全人抗體作為骨架（backbone），但理論上，由於結構上多了效應分子使其引起免疫應答的風險比裸抗更高。已獲批的ADC藥物的ADA發生率從1%到37%，鑑於有限的臨床研究經驗和ADCs藥物分子的特殊性，將其劃分為具有中等免疫原性風險。免疫原性是決定ADC的循環半衰期的主要因素之一，它會增加ADC的清除、降低其暴露。
1.4 其它
從已上市的ADC藥物的說明書上獲悉，ADC的PK在性別（除了特殊瘤種如膀胱癌外）、年齡上未見明顯差異。對於有肝和腎損傷的患者，由於肝和腎不是裸抗結構的主要代謝和處置器官，所以，主要需考察細胞毒藥物在該類患者的系統暴露，評價所存在的潛在風險。另外，ADC可能在患者間的暴露表現出較大的變異，除了可能由於與FcγR的結合具有差異所致，還可能受釋放效應分子、患者間腫瘤的大小、靶點等差異影響。
2 分布、分解/代謝、消除特徵
如前文所述，ADC在發揮藥效前會經歷幾個過程：從血漿中消除或者轉運至組織，直接與靶抗原結合或經組織間隙與受體結合，與抗原結合後內化至細胞中，經歷內吞小體-溶酶體（endosomal-lysomal）途徑，釋放效應分子；效應分子攻擊腫瘤細胞後，再通過體循環到達肝進行代謝和排洩。ADC不但擁有抗體的PK特徵，如：清除率低、半衰期長、淋巴轉運、FcγR/FcRn受體介導的體內循環、靶點介導的消除、非線性動力學特徵等，又因為其為多DAR值的組成成分、涉及效應分子解離、效應分子和linker的代謝等特性，使其呈現出特有的分布、分解/代謝、消除特徵。
2.1 分布
與單抗類似，ADC也是通過血液和淋巴系統進行轉運，具有較低的滲透率。由於組織間隙壓力作用使其聚集於血管區域，可分布在血、細胞外液及表達靶抗原的組織（如圖9所示），ADC和Tab的分布容積會高於血容量，釋放的效應分子以及代謝產物可廣泛分布於各個組織臟器。
圖9 ADC的體內分布 [Pharmaceutical Research, 2017]
ADC在各個組織的分布由於與靶點的結合及藥物理化性質差異而存在差異，肝臟、肺、腎和皮膚是ADC較為常見的分布器官。有研究發現，某些ADC藥物與抗體相比，在肝臟的分布明顯多（auristatin和calicheamicin conjugates）。同時，還發現在肝臟，效應分子的濃度明顯大於抗體的濃度，而在其它組織中抗體和效應分子的分布量相當，這可能是由於肝臟代謝釋放出更多效應分子所致。有些ADC的清除率和肝攝取率較單抗高，可能由於效應分子的結合增加了ADC的疏水性，從而增加了網狀內皮系統對藥物的清除能力。
釋放的效應分子的分布主要由自身理化性質決定，因此，親脂性強的藥物較親水性強藥物更易分布至細胞或組織。效應分子一旦與抗體結合形成ADC，它的分布特性會隨之改變，使其不再以自由擴散作用到達細胞和組織。此外，由於腫瘤的異質化，使得膜通透性高的細胞毒藥物可透過細胞發揮bystand effects，殺傷鄰近不表達或者弱表達靶抗原的細胞。效應分子可能是外排和攝取轉運體的底物，這些轉運體則可能會降低或增加效應分子在腫瘤或/和正常組織的分布。
不同於與血液腫瘤的直接結合，ADC與實體瘤結合需要經過四個過程：到達腫瘤血管、滲出血管、分布至腫瘤間隙、與靶點結合。以最少效應分子發揮最佳的藥效取決於腫瘤對ADC的攝取，腫瘤血管的密度、膜滲透性又是腫瘤攝取ADC的限速步驟。此外，改變ADC與FcRn的親和力、ADC的帶電性、理化性質以及靶點的內化等都會對ADC的分布產生影響。有研究者採用免疫缺陷動物模型發現，Fc相互作用會增加ADC在非靶組織（如脾）的分布。目前，可以應用放射性標記技術評價ADC的分布，近年來發展的全身定量放射性自顯影技術（quantitative whole-body autoradiography）也已應用到ADC藥物的組織分布研究中。
2.2 分解/代謝
ADC體內分解/代謝過程包括抗體分解代謝過程和小分子藥物體內代謝。ADCs在到達腫瘤細胞前，在細胞內（穩定型偶聯臂，non-cleavable linker）或者循環系統中（裂解型偶聯臂，cleavable linker）釋放效應分子，未結合的抗體和抗體片段遵循抗體的代謝途徑通過酶解產生胺基酸，被機體重新利用。ADC裂解或被分解代謝後可能形成的游離的小分子藥物和/或連有胺基酸殘基的小分子藥物和/或linker的小分子藥物代謝物，會進一步經歷肝CYP450酶代謝，還可能發生潛在的藥物藥物相互作用。除了ADC本身性質外，抗原的表達、受體/細胞密度，FcRn介導的循環作用、與Fcγ作用、受體介導的內吞作用、免疫原性等都會影響ADC的分解代謝。
2.3 消除
ADC也是通過分解代謝和排洩的方式進行消除。ADC可通過與靶點結合的特異途徑，進入溶酶體後發生降解，釋放小分子藥物後從體內清除；還可以通過非特異的胞飲作用進行清除，該途徑涉及新生兒受體（neonatal Fc receptor, FcRn）參與的循環再利用過程。ADC、抗體、分子量較大的多肽及胺基酸片段無法通過腎小球濾過排洩，而是以胺基酸的形式重新吸收利用。游離小分子藥物、分子量較小的多肽及胺基酸連接的小分子藥物、分子量較小的抗體片段可通過腎小球濾過進行排洩。同時，小分子藥物及代謝產物也可經酶代謝消除或通過轉運體排洩至糞便中。
ADC不同的部分在體內消除過程各不相同（如圖10所示），給予ADC後，血清/血漿Tab濃度高於ADC的濃度，並且緩慢消除。隨著小分子藥物從抗體上逐漸解離，ADC相對於Tab具有較快的清除率。釋放的小分子藥物的表觀消除半衰期通常與ADC的相同或略低，其摩爾濃度通常低於ADC的100-1000倍。
圖10 不同分析物的PK曲線示意圖[Pharmaceutical Research, 2015]
當分別給予抗體藥物和ADC時，ADC總抗體具有稍短的消除半衰期和稍高的清除率（如圖11所示），機制不明，可能由於ADC分子中效應因子的解離途徑對ADC清除率有額外的貢獻所致，或者由於小分子藥物作為外源物的引入被機體識別而啟動了非靶點介導的清除作用所致，ADC免疫原性的增加也可能導致上述結果。應用親水性linker可使ADC與裸抗的PK行為相近。
圖11 給予ADC與單抗後體內抗體血藥濃度曲線[Pharmaceutical Research, 2015]
ADC具有靶點介導的藥物處置（TMDD）特點，即低劑量下清除率高，高劑量時，靶點飽和清除率降低，呈現非線性動力學特徵。靶點的表達類型、表達量和內化率都會影響TMDD。此外，若ADC的靶點在循環中存在高水平脫落靶點，容易產生肝毒性。同時，循環中存在的可溶性和或脫靶靶點形成免疫複合物與ADC結合，還會增加ADC的清除、降低其暴露。
3. 動力學模型
應用模型的方法可以將PK、藥效和安全性數據進行整合，以滿足不同階段ADC藥物研發的需求，如：靶點的選擇、抗體的親和性、linker的穩定性、動物到人的外推、劑量的選擇和調整、E-R相關性研究（exposure-response relationships）、DDI研究等等。由於ADC具有多種清除途徑（解離和分解代謝），以及存在多種分析物的複雜的PK特徵，使得其動力學模型也較為複雜。不同的模型具有不同的應用，如可採用二房室模型和PBPK模型可以用清除率、解離、代謝速率等參數描述ADC的穩定性特徵。目前非房室模型、群體藥代模型、基於機制的模型、基於生理的模型在ADC藥物動力學研究中均有應用。
3.1 非房室模型（Noncompartmental Analysis, NCA）
早期的ADC藥物如Mylotarg主要是用NCA研究其消除半衰期及暴露特徵。NCA的方法通常需要較多的濃度-時間數據，但是不能描述ADCs相關分析物之間的關係。由於ADC研發後期的臨床試驗PK研究越來越少，檢測對象可能也只有ADC，通常，NCA適用於臨床研究的早期階段（Phases 1和Phases 2）。此外，NCA還可以作為其它模型的補充，共同解釋ADC的藥代機制。
3.2 群體藥代模型（Population PK Modeling, PopPK）
和NCA不同，PopPK會同時使用所有患者的多個分析物的數據，用以準確評估群體藥代特徵。PopPK可廣泛地應用於ADCs及其游離效應分子的評價、人體因素（如年齡、性別、種族、器官損傷）和外在因素（如聯用藥物）的考察、以及預測藥物的暴露來滿足暴露-效應關係模型的建立。考慮到ADCs各種分析物的分子量的差異，多分析物模型分析通常使用摩爾濃度作為濃度單位。
一般單分析物模型只關注ADC，因其與藥效直接相關。常應用線性清除的多室模型或者線性和非線性混合模型進行擬合建立ADC的模型（圖12a和圖12b）。早期的2個分析物模型是利用測定循環中ADC和總抗的濃度對二者進行描述（圖12c）。考慮到總抗體和ADC具有較高的相關性，未結合的ADC對藥效和安全性無重要影響，所以複雜程度更高的模型的應用反而會受到限制。但是，鑑於效應分子和安全性相關，2個分析物模型發展為可同時描述結合和游離效應分子的模型。效應分子的釋放包含分解代謝和解離過程，這兩個同時進行的過程會受到DAR值變化的影響（圖12d）。隨後模型發展為包含不同的患者，並且增加了效應分子的滯後室（圖12e）。但是滯後室的引入對每個過程各參數的準確評估提出了新的挑戰。圖12f模型可以描述非線性時間（非）依賴性清除，如果再加上總抗體的影響則可以應用圖3-8 g模型。
PopPK模型逐漸從單一的結構模型發展為可同時模擬多個具有相同效應分子和/或linker的ADC藥物的PopPK模型通用型具有一定通量的分析平臺。該平臺要求同時建模的ADC藥物具有同樣的外周室參數，並且個體間和殘差變異相同。該平臺的優勢是通過評估共同的藥代參數，可為其它具有相同的效應分子的ADC的篩選和優化提供參考。
圖12 應用不同方法建立的ADCs的PopPK模型[The AAPS Journal, 2020]。線性單分析物模型 (a)，線性和非線性清除的混合模型(b), ADC和總抗的模型 (c), ADC和游離的payload的2分析物模型 (d, e), 結合型payload和總抗 (f)， 結合型payload和游離payload (g)[The AAPS Journal, 2020]
3.3 基於生理的模型（Physiologically- Based Modeling, PBPK）
PBPK模型包含了所有腔室（血漿、血液、內皮、間隙和細胞內亞器官腔室等），還有抗體的FcRn作用，該模型適用於多種疾病狀態下ADC與靶點相互作用研究。PBPK模型無論是在ADC的臨床前候選物篩選階段還是在臨床階段都有廣泛的應用。PBPK模型可以模擬完整ADC和解離效應分子的不同的ADME特徵，對循環中的積累和安全性進行早期預測。與房室模型相比，PBPK模型可以提供基於機制的DDI相關研究，還可以用於僅有有限實驗或臨床數據時ADC的相關研究。但是該模型無法模擬免疫原性。而且，PBPK模型涉及800多個數學公式，較為複雜。
3.4 基於機制的模型（Mechanism-Based Modeling）
PopPK模型結合了一些機制研究，但本質上還是經驗性質的，主要是以血、血漿和細胞外室中的ADC各個對象為一整體。該模型不能反映出腫瘤細胞內的ADC和效應分子的量。由於眾多複雜的因素都會影響ADC在靶部位的分布和攝取，所以，基於機制的模型表現出更大的優勢，它可以包含多樣DAR的ADC，包含ADC處置、細胞外的效應分子和細胞內誘導細胞凋亡的效應分子等多維度變量。該模型可應用於臨床前候選物的篩選以及I期從動物到人劑量的選擇。DAR值多樣化模型如圖13所示，通常有一個獨立的房室，有相同的分布參數，每個DAR形態的解離取決於其濃度、結合效應分子的數量以及結合位置。該模型可用於指導ADC結構優化。
圖13 基於機制的DAR值多樣化ADC模型[The AAPS Journal, 2020]
有學者提出的多維度PKPD模型（如圖14）不但可以指徵循環和腫瘤細胞中ADCs及其效應分子的分布，還可以應用於非臨床到臨床有效性評價研究中。同時，隨著經驗腫瘤模型、多維度PKPD模型的發展使得預測腫瘤內效應分子的濃度成為可能。與腫瘤生長抑制的PD模型聯合時，腫瘤滲透模型可以幫助闡明ADC在鼠移植瘤模型上的作用效果。
還有從基於機制多維度方法衍生的體外bystand effects模型。這種模型不僅有助於理解腫瘤細胞內和鄰近細胞內空間影響因素和效應分子釋放機制對藥物分布的影響，還可以指導ADC結構設計，使效應分子可以更為有效地分布到各種類型的實體瘤上，甚至可以優化ADC的治療指數。
圖14 循環中和分布至腫瘤組織的ADC及其payload的多維度PK模型[The AAPS Journal, 2020]
生物分析
由於ADCs兼具小分子和大分子治療藥物的分子特徵，因此用於小分子或大分子兩種藥物典型的生物分析方法都是必要的分析手段。ADCs中存在多種不同的ADC分子，這些分子的不同之處在於DAR值和/或抗體與藥物結合的位點。另外，以目前的生產工藝製得的ADCs中通常還含有非ADC形式的物質，包括裸抗體以及游離的小分子藥物等。而當ADC分子進入體內後，偶聯藥物在循環過程中隨時間從ADC釋放，導致DAR的變化，其有效性和安全性也可能會受到影響。針對上述不同類型的分析物，需要根據藥物開發和評價的不同目的以及待測物的特點，選擇不同的分析手段完成檢測，這使得ADCs的生物分析非常具有挑戰。
ADCs生物分析策略需要集中三個領域的關鍵技術，用於PK評估的免疫分析方法和生物療法的免疫原性評估技術、基於LC-MS/MS的小分子藥物/代謝物鑑定的藥代動力學評價技術和基於親和捕獲色譜（affinity capture chromatographic）和LC-MS方法對生物基質中蛋白質結構的表徵技術。對於ADCs生物分析的一般策略可以分為以下幾個階段：一是開發新的方法來表徵血漿/血清中ADC分析物的分子結構以確定循環中不同DAR值的分析物。這種方法提供了ADCs體內過程的數據，例如，隨著時間的推移抗體是否仍然攜帶大部分共價結合的藥物。並且定量方法對DAR值的敏感性也很重要。二是結合傳統的大分子LBA、小分子LC-MS/MS分析，以及親和捕獲LC-MS/MS等新的分析方法，可以開發出可行的定量分析方法。在以後的臨床發展中，當對分析物與安全性和有效性的關係有了更好的理解時，就有可能通過聯合專業技術減少定量分析的數量。ADCs開發PK分析策略的要點首先包括使用適合的探索性方法來了解ADCs在體內外的DAR分布；然後發展一套多樣化的驗證定量分析，以衡量關鍵分析物：總抗體、抗體偶聯物和游離藥物。ADCs的PK生物分析方法如圖4-1所示。
圖15 ADCs的PK生物分析方法 [Bioanalysis, 2013]
1. DAR的分析
DAR是描述ADCs特徵的一個重要理化參數，它決定了小分子藥物的載量，同時影響著ADCs安全性和有效性。DAR的分析包括2個方面，一是平均DAR值，即測定體系中總的藥物分子和抗體分子的摩爾濃度之比；二是DAR的分布（如圖16），即具有不同DAR的ADC分子分別佔總的ADC分子的比例。DAR的分析方法包括光譜測定法、色譜-紫外測定法及質譜法，其中質譜檢測具有更高的靈敏度、特異性和準確性，對DAR的分析更具優勢。
具有不同DAR的ADC分子的絕對分子質量是不同的，可以據此採用ESI或MALDI質譜法對DAR進行分析。將樣品進行脫鹽或酶解處理後泵入質譜儀進行檢測，通過質荷比可以辯認出質譜圖上代表不同DAR的ADC的峰，然後根據各峰的面積可以得出各自的相對含量（即DAR的分布），最後通過計算得出平均DAR值。對於ESI質譜，一般需要先進行分離（如Hydrophobic interaction chromatography，HIC法）然後再進入質譜進行分析，但藉助於現代的高分辨質量分析器，如飛行時間分析器（TOF）和軌道離子阱分析器（obitrap）等，並輔以智能軟體進行去卷積計算，ESI質譜也同樣可以在沒有進行分離的情況下方便且準確地得到結果。一般來說質譜檢測是在肽水平上的，蛋白的結構信息不完整，為了保證ADCs分子的結構完整性，目前採用毛細管液相色譜-質譜（capillary liquid chromatography–mass spectrometry （affifinity capture LC-MS））來表徵ADCs在血漿/血清中的DAR分布。將生物素化靶抗原（如ECD）通過室溫孵育固定在順磁性鏈黴親和素微珠上，多餘的試劑衝走。然後將修飾後的磁珠與含ADC的血漿/血清在室溫下孵育，以使目標抗原捕獲ADC。隨後進行去糖基化。經過清洗以除去未結合和非特異性結合的蛋白質，使磁珠被分離出來。最後將ADC從磁珠上洗脫，注入毛細管LC-MS系統進行分析。
圖17 表徵ADCs DAR分布的方法（A）Affinity capture LC MS（B）affinity capture HIC [Bioanalysis, 2013]
2. ADCs血清/血漿定量研究
ADCs在體內的治療通常是由生物轉化、DAR清除率不同或這些過程的組合引起的複雜和動態變化的混合物。在這種情況下，現有的PK中對於「治療濃度」與時間的表述不再清晰。此外，標準曲線包含的標準物質可能不能代表體內變化的分析物，這對定量分析提出了獨特的挑戰。ADCs的藥代動力學研究中需要監測多種分析物，主要包括抗體偶聯物（Conjugated-antibody）、總抗體、結合型小分子藥物（Antibody-conjugated drug）、游離小分子藥物（nonconjugated Drug）以及毒素相關代謝物。這需要運用多種手段，主要包括LBA和LC-MS/MS等來進行不同分析物的定量分析。對於總抗體和抗體偶聯物多採用LBA方法，其要求和評價準則一般與對生物大分子的生物分析方法相似；而對於結合型小分子藥物、游離小分子藥物以及小分子藥物相關代謝物則多採用基於LC-MS/MS的方法，其要求和評價準則一般與對化學小分子的生物分析方法相似。這裡值得注意的是ADCs在方法學上需要對真實樣品和標準品中成分的不一致性和變化性（即DAR的不一致性和變化性）所帶來的定量可靠性問題進行考證。
2.1 基於LBA的總抗體的測定
對於總抗體，通常以常規ELISA方法或電化學發光免疫方法（ECLA）進行分析，ECLA與ELISA同屬於LBA法，但與ELISA不同的是，ECLA採用電化學發光技術來獲取信號，靈敏度更高，動態範圍更廣，如圖18所示。
圖18 基於LBA的生物分析（A）經典ELISA（B）ADC總抗體ELISA（C）ADC抗體偶聯物ELISA. [Bioanalysis, 2013]
對於非臨床PK和TK研究，選用的捕獲試劑和檢測試劑可以是結合到抗體的非可變區域的多克隆抗人抗體。但在臨床試驗中，可使用結合重組抗原、抗獨特型或抗互補確定區（Anti-complementarity determining region，CDR）抗體，以最小化血清蛋白背景。對於用於非臨床和臨床開發的所有ADCs總抗體檢測模式，重要的是要確保所有體內預期的DARs都準確的定量為總抗體濃度。因為當一個ADC分子具有高DAR時，藥物可能會阻礙實驗試劑與ADC的抗體部分的結合。也有可能高DAR由於疏水性而聚集，不能有效地與檢測試劑結合。
2.2 ADCs的偶聯PK分析物
與總抗體分析一樣，ADCs的偶聯PK分析物的定量分析需要檢測異質分析物混合物。通常用兩種方法定義ADCs的偶聯PK分析物：從抗體的角度來看，可以定義為附著一個以上藥物的抗體分子；從載藥量的角度，即結合到抗體上的藥物的總濃度。不論採用那種定義，偶聯PK分析物的分析均提供了更敏感的藥物負荷變化分析。此外，偶聯PK分析物的分析提供了與總抗體分析明顯不同的信息。因此，通過對偶聯PK分析物和總抗體的分析，可以簡單地根據ADCs的兩種關鍵分子成分（例如抗體和藥物）的總量來定義異質性DAR混合物。總的來說，在技術可行的情況下，抗體偶聯物和結合型小分子藥物是目前首選的ADCs的偶聯PK分析物。
2.2.1 基於LBA的抗體偶聯物的血清/血漿定量研究
通常使用ELISA法測定血清中的抗體偶聯物。LBA法能分析所有DAR分析物，但不包括參考標準物中的裸抗體或體內完全解離導致的裸抗體。然而，這種分析物的缺點是它不能提供藥物負荷的直接信息。這是因為分析模式決定了只有一種藥物可以與酶聯免疫吸附試劑結合。在最佳的分析條件下，只含有DAR=1的樣品的信號與含有較高DAR的樣品是相同的。因此這種檢測方式有其局限性。另外，確定對單個DAR的檢測性能也很重要，但可能無法獲得單獨的DAR，檢測性能可能需要使用富集DAR來表徵，或通過使用親和捕獲LC-MS評估DAR與檢測試劑的結合來間接評估。不像在總抗體分析中，由於空間位阻，理論上與高DAR的結合可能很差，而在抗體偶聯物ELISA中，與低DAR（如DAR=1）的結合可能由於低親和度而很差。如果在試驗中不能準確地檢測到低DAR，則PK圖譜將高估藥物完全解離的量。
2.2.2 基於LC-MS/MS的結合型小分子藥物的血清/血漿定量研究
結合型小分子藥物的分析被設計用來檢測共價結合到抗體上的所有藥物分子的濃度。該方法提供了藥物負荷的直接信息，並對藥物負荷的任何變化高度敏感。但該分析不能檢測結合到藥物上抗體的數量。抗體濃度是直接使用總抗體測定法檢測的，如前面所述（圖19）。
結合型小分子藥物檢測首先通過Protein A結合、連接物裂解的方法從血漿中分離ADCs（圖19A），然後用LC-MS/MS分析藥物（圖19B）。
圖19 結合型小分子藥物的親和捕獲LC MS/MS分析（A）親和捕獲和連接裂解/ADCs消化步驟（B）蛋白沉澱和LC質譜/質譜分析步驟 [Bioanalysis, 2013]
linker的裂解可以是酶的，也可以是化學的，這取決於linker的結構。同樣，用單獨的或富集的DAR來評價試驗中是否存在對DAR的偏倚也很重要。理論上對於高DAR，在最初的親和捕獲步驟中與Protein A的結合可能受到空間阻礙，但該試驗有一個使用現成的試劑通用的模式，用Protein A和適當的蛋白酶或化學試劑的連接裂解。由於Protein A結合和分離的連接劑對不同抗體的影響不大，因此可以快速地對使用相同linker但不同抗體的ADCs進行檢測。然而，關鍵在於為每個新的ADC生成標準曲線，以確認該實驗的性能。值得注意的是最後LC-MS/MS檢測的分析物的標準品是由完整的ADC參考標準品製成，並經過親和捕獲和linker裂解步驟，以與樣品分析物相同的方式生成的藥物。需要注意的是，雖然該分析使用傳統的LC-MS/MS為最終分析步驟，但分析物（結合型小分子藥物）卻有所不同，該分析實際上是一種混合配體結合與LC-MS/MS的新的分析類型。雖然目前結合型小分子藥物分析的模式更適用於連接可分裂的ADCs。但在理論上是可以通過Protein A的親和捕獲和徹底的非特異性蛋白水解反應來檢測具有不可分裂linker的ADCs的結合型小分子藥物，從而得到胺基酸linker藥物。對於具有工程偶聯位點的ADCs，可以使用特定的蛋白酶裂解抗體生成肽連接藥物。
對於這兩種類型的偶聯PK分析物，可以結合總抗體定量分析的數據來間接獲得其他相關信息。例如，可以從抗體偶聯物分析和總抗體分析結果的差異中間接得到藥物完全解離的程度的情況（圖20A）。這是因為總抗體測定所有DAR，包括DAR=0，而抗體偶聯物測定所有DAR結果相同，除了DAR=0。因此，如果連接物是相對穩定的，而完全解離（DAR=0）的佔比≤20%，那麼抗體偶聯物試驗將提供與總抗體試驗基本相同的信息，因為兩種試驗唯一的區別是DAR=0的檢測能力。另一方面，結合型小分子藥物分析提供了與總抗體分析明顯不同的信息，並且可以很容易地檢測血漿中藥物負荷的微小變化。理論上，結合型小分子藥物與總抗體結果之間的關係可以反映平均DAR隨時間的變化（圖20B）。通過對結合型小分子藥物和總抗體的分析，可以簡單地描述ADCs的複雜分析物DAR混合物，即抗體總量和結合型小分子藥物總量。
圖20 比較總抗體分析數據和抗體-藥物偶聯物分析數據的理論推論（A）總抗體ELISA和抗體偶聯物ELISA（B）總抗體ELISA和結合型小分子藥物親和捕獲LC–MS/MS [Bioanalysis, 2013]
2.3 基於LC-MS /MS的小分子藥物及其代謝物的定量分析
對於血漿中游離的小分子藥物和這些帶有藥物結構的相關代謝產物，在LC–MS/MS定量之前，需要進行蛋白沉澱和/或固相萃取去除血漿蛋白（圖4-4B）。如果需要對藥物相關代謝物進行定量，就需要先鑑定出這些體內代謝產物並製備出其標準品，只要確定了主要分解代謝物的結構併合成穩定同位素標記的內標物或模擬分子，傳統的小分子LC–MS/MS分析方法就可以用於小分子分解物的非臨床和臨床研究。在某些情況下，如果藥物有活性部分，如磺胺基，從ADC釋放的藥物可能二聚或共價結合到血漿蛋白上。則需要增加樣品製備步驟，以化學方法減少血漿樣品以釋放任何二聚化的藥物或與血漿蛋白共價結合的藥物。另外，對於ADCs，需要評估分析物在ADC存在下的穩定性。這一點很重要，因為除了藥物分析物濃度在儲存過程中由於不穩定而下降外，藥物濃度也可能由於儲存過程中藥物從ADC釋放而增加。根據文獻經驗，在非臨床/臨床研究中所測到的游離藥物不到結合型小分子藥物摩爾濃度的1%。然而，即使ADC在存儲期間釋放少量藥物，也會對游離藥物分析產生很大影響。例如，在游離藥物佔結合型小分子藥物摩爾濃度1%的樣品中，在存儲過程中ADC釋放0.5%的藥物將導致游離藥物量增加約50%。
3 ADCs的免疫原性分析
與所有生物製劑一樣，ADCs具有誘發免疫反應的潛力。這可能包括涉及多個ADC成分的抗體、連接劑、藥物或表位的ATA（Anti-therapeutic antibody）。除了與所有生物製劑一樣的免疫原性外，ADCs還有其獨特之處，比如ADC分子或帶有藥物分子的ADC片段與ATA結合後產生獨特的免疫複合物可能將細胞毒性藥物送到非預期的位置。免疫原性的分級遞進式策略可篩選和表徵ADCs的所有分子成分的ATA反應（圖21）。
圖21 ADCs的ATA檢測策略示意圖. [Bioanalysis, 2013]
3.1 ADCs ATA的分析
一般採用ELISA、橋聯ELISA、ECLA以及放射免疫沉澱法等對ATAs進行定性或半定量分析。例如，圖22A描述的是對抗體ATAs的檢測，圖22B描述的是對藥物ATAs的檢測，使用了生物素標記的ADCs和DIG（Digoxigenin）標記的ADCs實驗試劑。這些檢測使用非臨床免疫接種獲得的替代ATA陽性對照進行特徵分析。此外，在ADCs試驗開發過程中，使用抗藥物抗體來評估試驗的相對敏感性，因為免疫反應可能是由抗體或藥物表位引起的。檢測閾值通常使用50~100個人，設置假陽性率為5%來確定。由於循環中的ATAs可能部分或完全與ADC複合，因此要確定在ADC存在的情況下檢測ATAs的檢測條件。例如，檢測試劑通常需要過量或孵育過夜，打破ADC-ATAs複合物的平衡，使其能夠與檢測試劑結合（圖22）。檢測的目的是評估存在不同數量ADC時的相對分析敏感性。為了優化分析檢測，達到高ADCs耐藥性，可以選擇在ADCs濃度較低的時間點時收集樣本。
圖22 ATAs檢測抗體或連接藥物的免疫反應模式圖（A）ATA directed to antibody（B）ATA directed to linker drug [Bioanalysis, 2013]
對於非臨床分析，ADCs ATA的藥物耐受性摩爾比在60:1和170:1之間。對於臨床試驗，耐藥比率在50:1和400:1之間。雖然ATA測定法的相對敏感性和耐藥性取決於所使用的替代ATA陽性對照，但總的來說，目前觀察到敏感性通常在低ng/ml範圍內，在數十μg/ml的ADCs中檢測到數百ng/mL的ATAs。對於所有的生物治療藥物來說，基於分子結構預測非臨床或臨床研究的免疫原性都十分具有挑戰性，且非臨床免疫反應通常不能預測臨床免疫反應。對於ADCs來說，預測不同抗體、linker或藥物的影響更具挑戰。例如，在食蟹猴體內，相同的抗體，不同的連接藥物會表現出非常不同的免疫反應。
3.2 ADCs抗藥抗體中和活性分析
抗體類藥物中和抗體分析的試驗要依據藥物的作用機制（mechanism of action，MOA）以及試驗的靈敏度、選擇性、精密度、藥物耐受性及產生的NAb對受試者的影響等因素來選擇。ADCs所採用的效應細胞毒分子分為抑制有絲分裂的細胞毒素和促進DNA裂解的細胞毒素兩類，部分ADCs藥物也可以通過抗體依賴的細胞毒性（ADCC）和補體依賴的細胞毒性（CDC）發揮作用。ADCs的單克隆抗體和細胞毒素等不同結構域按照一定的順序參與細胞殺傷效應，靶向單克隆抗體或細胞毒素的NAb可能阻斷ADCs的細胞殺傷活性，因此單獨採用細胞增殖凋亡等細胞功能性試驗，可較好地反映ADCs的作用機制，用於評價ADCs產生ADA的中和活性。鑑於ADCs的作用機制，FDA，EMA等監管機構首推基於細胞的生物活性試驗用於ADCs的中和抗體分析。
3.2.1 基於細胞的生物學試驗（cell based assay）
一是以細胞酶促反應為基礎的細胞試驗，樣本中存在的NAb可以降低ADCs介導的細胞活性或增殖抑制，根據一定濃度ADCs作用後細胞活性的改變，判定NAb是否存在。二是以蛋白水解酶等為基礎的細胞試驗，細胞中的蛋白水解酶、煙醯胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）等可用於定量分析活細胞、凋亡或死亡細胞的數量，進而用於評價抗ADCs抗體對凋亡抑制的中和活性。三是以細胞代謝標誌物作為檢測指標的細胞試驗中，細胞代謝的標誌物，如三磷酸腺苷（ATP）、乳酸脫氫酶（LDH）等的濃度水平的變化可作為檢測指標用於評價細胞的活性。以上都有成品試劑盒可供選擇，選擇一種即可。
3.2.2 非細胞的競爭性配體結合試驗（non-cell competitive ligand-binding assay，CLBA）
基於細胞的中和抗體分析試驗比CLBA試驗更能反映ADCs體內發揮作用的情形，但細胞試驗受基質或藥物幹擾較大，試驗的靈敏度較低，樣本的酸解處理可能會影響細胞的活性，因此在一些情況下，如經過充分的論證，也可考慮採用CLBA進行ADCs抗藥抗體中和活性分析。CLBA是基於NAb與藥物靶蛋白競爭性結合藥物，若樣本中含有NAb，則表現為藥物與靶蛋白的結合被一定程度抑制。CLBA試驗系統通常較基於細胞的試驗系統有更高的靈敏度精密度，良好的藥物耐受，還可耐受較強的基質幹擾。經FDA和EMA批准上市的Adcetris和Kadcyla以及在研的Cantuzumab mertansine、MEDI47等ADCs也採用基於橋連的ELISA或ECL方式進行免疫原性評價。另外，ADCs的抗藥抗體表位分析可採用競爭法或直接檢測的方法。競爭法表位分析的原理與確證試驗類似。
展望
本文所述的ADC藥物知識梳理主要是基於目前已經批准和研究較為廣泛的分子形式，即一個完整IgG分子通過可斷裂或不可斷裂的linker和細胞毒性藥物共價偶聯，但ADC藥物的研究領域遠不止於此。回到ADC最基本的原理，將結合特異性的分子和高藥效活性的分子偶聯在一起，融合兩個分子的結合特異性和高藥效活性。從這樣一個層面出發，重新認識ADC藥物，我們一定要完整抗體嗎？一定要細胞毒性藥物嗎？拋開固有的思維僵視，抗體部分我們完全可以選擇抗體片段，納米抗體等增強ADC藥物的腫瘤滲透；或者選擇雙特異性抗體、前體抗體（Probody）等增強ADC藥物的靶點特異性；亦或者可以偶聯抗生素、寡核苷酸、免疫調節劑等小分子藥物，拓展ADC的作用機制及在非腫瘤領域的應用；亦或者引入poly-linker增加藥物負載，拓展高安全但低藥效分子的應用。儘管ADC藥物的研究已經迎來了爆發式發展，但還遠沒有到百花齊放的局面，ADC藥物研發還有很多可能可以挖掘，期待更多創新機制的ADC藥物分子走向市場。
在ADC藥物的研發進程中，生物分析起著非常重要的作用，通過不斷發展的生物分析技術，深入全面地闡明ADC藥物的PK/PD特徵，對於推動研發出更加低毒高效的ADC藥物至關重要。ADC藥物作為大、小分子共價偶聯的複合物，對生物分析技術要求也極高，而集大/小分子服務於一體的綜合性平臺，必將在ADC藥物的生物分析中顯示出更加強大的優勢。
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