湯姆叔叔
一名堅忍的基督徒奴隸。斯託夫人將湯姆塑造成一位「高貴的英雄」以及值得稱頌的人物。在整部作品中，湯姆不僅忍受著剝削帶來的痛苦，還始終堅持著自己的信仰，到了最後連他的敵人也不得不敬重他。
伊麗莎
是一名奴隸（謝爾比夫人的女僕）。在得知自己5歲的兒子哈裡將被賣給奴隸販子黑利後，她帶著哈裡逃向了北方。在俄亥俄州時，她與丈夫喬治·哈裡斯重逢。他們一家人移居到了加拿大，然後再到了法國，最終定居於賴比瑞亞。
喬治
喬治聰明機智，但被他的主人所嫉妒，所以他的主人無休止地折磨他。於是，他出逃了。他是一個渴望自由的人。
伊娃
伊娃的全名為伊凡吉琳·聖克萊爾。當湯姆叔叔被輪船運送到紐奧良的途中，伊娃進入了故事的敘述中。當這名5、6歲的小女孩落水後，湯姆叔叔將她救了起來。伊娃懇求她的父親買下了湯姆，在跟隨聖克萊爾家來到紐奧良後，湯姆成為了聖克萊爾莊園的一名馬車夫。不過，湯姆在這裡的大部分時間都是與天使般的伊娃一起度過的。
賽門·勒格裡
是一名出生於北方的殘暴的奴隸主。他的名字後來成為了貪婪與殘暴的代名詞。他的目標是擊垮湯姆並破壞他的宗教信仰。但湯姆並沒有屈服，最終死在了勒格裡的亂棍之下。
託普西
是一名不知來自何方的「衣衫襤褸」的奴隸女孩。古靈精怪，天真活潑。當被問到是誰造了她時，她既不認為是上帝，也不認為是她的母親，「我想我是自己長出來的，我不相信有誰造了我」。在後來，她被小伊娃的友愛純真感動了，開始學習好的一切。
其他人物
在《湯姆叔叔的小屋》中，還有著許許多多的次要角色。
亞瑟·謝爾比：湯姆在肯塔基州時的主人。謝爾比被塑造成了一位「仁慈」的奴隸主與傳統的南方紳士。後來因為債務不得不賣掉湯姆和哈裡。
埃米莉·謝爾比：亞瑟·謝爾比的妻子。她是一位深信宗教的婦女，並努力用她的仁慈與道德來影響她的奴隸們。當她的丈夫將把奴隸賣給奴隸主時，她為之感到震驚難過。作為一名女性，她並沒有合法的地位去阻止這件事的發生，因為所有的財產都屬於她的丈夫。
喬治·謝爾比：亞瑟與埃米莉的兒子。正直善良。他將湯姆視作自己的良師益友，也是一位虔誠的基督徒。
奧古斯丁·聖克萊爾：湯姆的第二位主人，小女孩伊娃的父親；是小說裡面最具同情心的奴隸主。聖克萊爾已然意識到了奴隸制度的罪惡，但卻還未能為割捨它所帶來的財富作好準備。在他的女兒死後，他變得更加地信奉宗教，並開始閱讀《聖經》給湯姆聽。但是，他的好意卻由於他的意外身亡而終成泡影。