使用冷凍電鏡斷層成像和子斷層圖像平均法解析的囊膜病毒比較。圖源：李賽團隊
引 言
近期，清華大學李賽團隊利用冷凍電鏡解析了新冠病毒結構，為人們理解新冠病毒提供了直觀的認識。在下面的這篇文章中，李賽不僅介紹了新冠病毒的結構研究，還解讀了新冠病毒所屬的囊膜病毒的結構研究。
囊膜病毒指外圍有脂質雙層膜包裹的病毒，我們經常聽到的天花、B肝、C肝、愛滋、狂犬、新冠、寨卡等病毒，均是囊膜病毒。與無囊膜病毒相比，囊膜病毒可謂長相隨機，千毒千面，給試圖看清它們的科學家帶來了極大的挑戰。
來源：知識分子，ID：The-Intellectual
撰文：李賽
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人類的發展史，也是一部和各種瘟疫鬥爭的生存史。瘟疫的罪魁禍首裡，既有引發鼠疫、霍亂、結核病、傷寒等瘟疫的細菌，也有引發天花、流感、麻疹、愛滋等大流行病的囊膜病毒（enveloped virus）。生活在一個科技高速發展的時代，每當我們以為人類已經克服了以上多數病原體的時候，總有新的麻煩出現。
回顧過去短短20年，全球便經歷了新冠、SARS、MERS、非洲豬瘟、伊波拉、寨卡病毒等多種新髮型囊膜病毒所引發的疫情。這些病毒的出現，不僅給全球人類健康帶來巨大危險，給全球經濟造成巨大損失，也在潛移默化的改變我們的生活方式。這些經歷，讓我們對大自然始終保持畏懼，也對囊膜病毒本身產生了極大的好奇。
無囊膜病毒與囊膜病毒的區別是什麼？囊膜病毒的組裝有哪些類型？千面的囊膜病毒到底長什麼樣？今年的諾貝爾生理學或醫學獎頒給了C肝病毒的發現者，這次疫情，也將全球目光再一次聚焦到冠狀病毒所屬的囊膜病毒上。作為一名病毒學家，筆者和同事在今年解析了屬於囊膜病毒的新冠病毒的結構。藉此機會，筆者嘗試就囊狀病毒的結構與冷凍電鏡技術的發展等問題分享自己的思考。
01
「千毒一面」 與 「千毒千面」
無囊膜病毒
無囊膜病毒（nonenveloped virus）沒有囊膜，直接由蛋白質外殼包裹。這類病毒的範疇比較廣，從動物病毒、噬菌體、到水生病毒等都有。對人類健康及經濟生產威脅較大的有同屬微小病毒科的脊髓灰質炎病毒、腸道病毒及口蹄疫病毒等。
在結構上，大多數無囊膜病毒就像一個模子刻出來的一樣。呈正二十面體組裝的病毒是它們的代表。這些直徑100 nm左右的超大分子複合物，由於高度的對稱性、結構的全同性及尺寸恰好在電子顯微鏡的透射範圍內等特徵，為結構解析工作帶來了極大的便利，是冷凍電鏡方法開發歷程中的三大標準生物樣品之一（另兩種：脫鐵蛋白，核糖體）。
因此可以說，冷凍電鏡斷層成像技術（cryo-Electron Tomography, cryo-ET）的開發幾乎是伴隨著對無囊膜病毒結構的解析與組裝機制的深度解讀一起成長的。目前使用冷凍電鏡解析常規尺寸的正二十面體病毒方法非常成熟：由於其表面拷貝數非常高的衣殼蛋白以嚴格的對稱性分布，無需大量數據便可通過三維圖像重構獲得近原子解析度。這個經典應用也為探索更複雜的病原體（包括大量非球形或非對稱性的病毒體）提供了堅實的基礎。
（左）正二十面體組裝的水呼腸病毒，彼此之間幾乎全同 圖源：[4]；而（右）以新冠病毒為代表的囊膜病毒，千毒千面，幾乎沒有兩顆一樣的病毒顆粒 圖源：[1]
著名的病毒結構生物學家Stephen Fuller和Timothy Baker比較了早期冷凍電鏡解析的正二十面體型病毒的結構 圖源：[5]
囊膜病毒
包括新冠病毒在內的囊膜病毒則多是動物病毒，它們可以說是現代人類面臨的最具威脅的病原體。囊膜病毒的大家庭裡，既有迫害人類多年，惡名昭彰的 「老大哥」 們：比如天花、流感、B肝、C肝、麻疹、愛滋、登革、狂犬病毒等；也有近幾十年才引起關注或被發現的 「小鮮肉」們：比如新冠、拉沙、伊波拉、寨卡、裂谷熱病毒等。這些病毒裡，除了寨卡和登革病毒具有較為嚴格的正二十面體對稱外，其餘的長相均較為隨機。
這種隨機性與囊膜病毒的組裝和生命周期特點息息相關。它們由脂雙層包裹，藉助外鑲的刺突狀糖蛋白與受體結合併進入細胞。接著，利用I、II或III型膜融合蛋白介導膜融合、解胞並釋放核酸，綁架細胞的生命活動實現自我複製，最後組裝成新的病毒並從細胞出芽。可見，囊膜病毒通過蛋白介導膜融合，通過膜融合去組裝並釋放核酸，通過出芽 「擄走」 細胞膜以成為新病毒的囊膜。
除了上述的刺突蛋白及脂雙層外，囊膜病毒一般還有基質蛋白（負責病毒組裝）、核蛋白（負責收納組織核酸），負鏈RNA病毒的結構蛋白裡還有聚合酶。此外，不少囊膜病毒還有通道蛋白，例如新冠病毒，流感病毒等。
由於脂雙層參與病毒組裝，這類病毒幾乎千毒千面，沒有兩個完全一樣的病毒。看清囊膜病毒的全病毒分子結構，其蛋白的分布及構象轉變，甚至是宿主體內的病毒半組裝結構，對我們理解囊膜病毒如何攻下細胞這座城堡至關重要。這也會啟發我們找到病毒的弱點，為我們設計中和抗體和疫苗去擊潰這些病毒提供更加巧妙的策略。
然而針對囊膜病毒的結構工作，目前仍主要通過晶體學或單顆粒法解析在體外重組蛋白的結構。而冷凍電鏡在組裝柔性、不對稱、不具全同性的囊膜病毒及其他類似大分子複合物的三維結構和功能研究中發揮著不可替代的作用。
由於囊膜病毒的長相隨機，很難通過傳統結構生物學方法解析，因此全病毒結構及其在生命周期中重要狀態的高分辨結構，一直是結構生物學的挑戰。使用冷凍電鏡斷層成像方法拍攝樣品的三維圖像，並結合子斷層圖像平均法（STA）對病毒上的蛋白子斷層圖像進行對齊平均運算，再通過投射回三維空間的手段，為解析囊膜病毒全病毒結構及細胞內的病毒結構帶來可能。
02
從囊膜病毒組裝模型看結構研究發展
隨著顯微技術及結構生物學的發展，結構病毒學家們看到的更多更清楚，也引出了越來越多的生物學研究興趣。他們不再滿足於僅僅解析體外表達的病毒蛋白，或正二十面體類全同病毒的衣殼時，而將目光更多的轉向對人類威脅更大、變異更快、非定型不全同的囊膜病毒。
它們看似隨機的組裝有規律嗎？結構蛋白的拷貝數是固定的嗎？蛋白與核酸之間的互相作用是怎樣的？從外表到內部，從局部到全局…… 結構病毒學的研究人員正在接受著越來越多新的挑戰。下面我們圍繞囊膜病毒的九種組裝模型,看看囊膜病毒結構研究的發展。
九種組裝類型的囊膜病毒示意圖 圖源:[6]
具有二十面體對稱衣殼的囊膜病毒顆粒
最早被解析的囊膜病毒是有正二十面體對稱特徵的。這類病毒，例如裂谷熱病毒、登革病毒等，均具有II類膜融合蛋白，這些蛋白結構高度保守並呈多種多聚形式。它們沒有基質蛋白，取而代之利用糖蛋白組裝成衣殼。
1995年德國海德堡歐洲分子生物學實驗室 Stephen Fuller 等通過單顆粒平均法（SPA）解析了 Semliki 森林病毒（SFV，披膜病毒科）結構[7]。該病毒主要通過蚊蟲叮咬傳播，在齧齒動物中引起致命的腦炎，在人類中通常只有輕度的症狀。它具有二十面體蛋白外殼、脂質雙層膜以及二十面體對稱的核衣殼。在當時有限的解析度下，只能看到病毒的輪廓。
第一類囊膜病毒：由糖蛋白組裝成正二十面體外殼，包括單層殼的RVFV和雙正二十面體殼的SFV 圖源：[8,9]
同樣具有二十面體外殼和脂雙層膜、但沒有二十面體核衣殼的另一類病毒，也在早期就被解析出來。引起發病率和死亡率很高的登革出血熱和登革休克症候群的登革熱病毒（DENV，黃病毒科），於2002年被美國普渡大學 Richard J Kuhn 等人確定了24 解析度的結構[10]，這是解析的第一個黃病毒結構。2013年，直接電子檢測器（DED）的出現以及電子顯微鏡硬體和圖像處理軟體方面的進步，催生了冷凍電鏡的 「解析度革命」，使得近原子解析度成為可能。而在 cryo-EM 的 「解析度革命」之前，UCLA 的周正洪教授團隊就通過CCD相機獲得了3.5 解析度的成熟登革熱病毒結構[11]。
常在非洲與阿拉伯地區爆發的裂谷熱病毒（RVFV，白蛉熱病毒屬），和DENV具有相似結構，由於其表面糖蛋白的柔韌性，早期基於單顆粒冷凍電鏡重建的三維結構僅限於20 左右的解析度。直到2018年，我與牛津大學 Steinar Halldorsson 等同事通過採取改進樣品製備策略、局部重建等手段獲得了8-13 的RVFV病毒結構，並闡明了其融合機制[12]。
僅囊膜內具有二十面體蛋白殼層的病毒
除了上述兩種在囊膜外側具有二十面體對稱蛋白外殼的病毒外，還有一類病毒的外囊膜包被著一層或多層二十面體對稱蛋白或核衣殼：包括B型肝炎病毒HBV[13]、皰疹病毒科（如HSV-1 [14]），以及19年饒子和團隊解析的非洲豬瘟病毒ASFV[15]。
第二類囊膜病毒：外囊膜包被著一層或多層正二十面體對稱蛋白衣殼 圖源：[6]；Dryden et al., 2006; Wang et al., 2019; Grunewald et al., 2003.
非二十面體對稱囊膜病毒及其糖蛋白
解析度革命之後，以單顆粒方法解析正二十面體對稱蛋白殼的結構已近成為常規。但蛋白外殼具有二十面體對稱性的囊膜病毒畢竟僅是少數，大部分囊膜病毒因為構象差異較大，無法通過單顆粒法獲得完整結構。這給高解析度冷凍電鏡結構解析帶來了挑戰。而高分辨冷凍電鏡斷層成像（cryo-ET），因原始數據帶有精確的Z軸信息，結合使用子斷層圖像平均法（STA），已被證明具備獲得近原子解析度的能力。由於其在囊膜病毒原位結構方面獨特的優勢，被越來越多地用於研究病毒粒子的整體超微結構。
擁有I型膜融合蛋白的病毒是囊膜病毒中被研究最多、最具代表性，也對現代人類健康最具威脅。HIV與流感病毒匯聚了病毒研究領域的大多數資源，近20年反覆爆發的冠狀病毒、伊波拉病毒等也在快速吸引科研投入。此類病毒表面的糖蛋白呈三聚體並隨機分布，膜附近的基質蛋白為病毒提供組裝。
從1981年美國確認了首例愛滋病感染者到2018年，全球已有3200萬人死於愛滋病。人類對於HIV病毒的基礎研究從未止步，針對HIV病毒結構的認識也在越來越精細，但目前針對HIV病毒的有效疫苗仍然缺乏。HIV由外囊膜及其包圍的含病毒基因組的核衣殼組成。2008年劉駿等人利用冷凍電鏡斷層成像法揭示了HIV的糖蛋白在病毒表面的原位結構及其與抗體的複合物結構 [16]， 2013年章佩君團隊揭示了成熟HIV圓錐形衣殼上的衣殼蛋白CA排列成六聚體和五聚體的精細結構 [17]。
在非洲地區頻繁爆發的拉沙病毒（LASV, 沙粒病毒科），屬於生物安全四級（BSL-4）的急性出血熱病毒，致死率可達20%。2016年，我和同事就對滅活的拉沙病毒進行了病毒及其糖蛋白的首次三維重構，揭示了糖蛋白14 解析度的原位結構，並通過構建病毒樣顆粒（VLP）揭示了拉沙病毒糖蛋白在酸性環境下的構象變化過程，與細胞內受體LAMP1的複合物結構，並從結構上解釋了為何糖蛋白只有在低pH下才會與LAMP1結合[18]。2017年，Scripps 研究所 Erica Sapphire 研究員從非洲疫情爆發區拉沙熱生還者血液中獲得中和性抗體，並解出糖蛋白胞外區三聚體與抗體複合物的晶體結構，驗證了我的研究中早期電鏡結構的真實性[19]。
第三類囊膜病毒：具有I型膜融合蛋白，糖蛋白隨機分布，有基質蛋白 圖源：[6,18]
今年肆虐全球的新冠病毒，由我們清華大學團隊使用 cryo-ET，將浙江大學李蘭娟團隊提供的滅活病毒解析至最高7.8 解析度，並重構出一顆有代表性的新冠病毒全病毒分子結構[1]。我們不僅展示了病毒表面刺突蛋白（spike）的結構、分布及其糖基化組分，還挺進 「深核」，解析出病毒腔內的核糖核蛋白（RNP）的結構與排列規律，為其超長基因組在病毒體內的分布提供了高解析度信息，繪製了獨一無二的新冠病毒全身 「通緝照」。
2020年8月至9月間，《細胞》（Cell）、《科學》（Science）、《自然》（Nature）分別報導了我們團隊[1]、德國馬克思·普朗克生物物理所 Martin Beck 團隊[2]、以及英國劍橋 MRC-LMB 的 John Briggs 團隊[3]三篇分別利用冷凍電鏡斷層成像技術解析新冠病毒原位結構的研究論文。
冠狀病毒本身非常有特點，擁有多個囊膜病毒之最：已知最大的糖蛋白（三聚體分子量超過600kD），RNA病毒中最長的RNA（30kb）。我們的工作發現，新冠病毒糖蛋白拷貝數稀少（~30個）；在囊膜表面擁有極大的自由，可繞莖部旋轉甚至可在囊膜上遊走；非常脆弱，部分亞基甚至整根糖蛋白會發生脫落。通過對來自天然S蛋白的N-聚糖組成進行質譜分析，發現雖然天然聚糖較為複雜，但整體而言與重組糖蛋白聚糖的加工狀態高度相似。
冠狀病毒RNA直線長度可達病毒自身直徑的100倍。把這根核酸「長繩」完整有序地纏繞進僅有約80nm直徑的腔體內的重任主要落在核蛋白上。它需要像線軸一樣收納RNA，將其有序纏繞，並組裝成稱為核糖核蛋白複合物（RNP）的高級結構，才能將RNA完整塞進體內。在病毒發生膜融合及去組裝後，它又能有條不紊的與RNA解綁，讓它順利進行複製。這個包裝方法及過程，不僅對於新冠病毒是個未解之謎，甚至在所有正義單鏈RNA病毒中也是幾何謎題。
我們團隊對病毒內近20,000顆RNP進行了挑選和分析，得到了病毒腔內13 解析度的RNP結構密度圖，並開創性地展示了RNP在病毒腔內的組裝機制。成像顯示，該複合物像串珠一樣將RNA組織在一起，並在病毒體內呈現六聚 「鳥巢」 型和正四面體 「金字塔」 型兩種局部排列，有序地收納了RNA這根 「長繩」，還增加了病毒在複雜環境中經受物理挑戰的能力。這可能是世界範圍內首次 「看清」 正義單鏈RNA病毒的內部結構。
新冠病毒從內到外的全病毒結構 圖源：[1]
伊波拉病毒屬於絲狀病毒科，可引起人類及其他靈長類動物產生伊波拉出血熱，是當今世界上最致命的病毒之一，致死率可達50%-90%。2014年爆發的伊波拉疫情，在全球引發約2萬人感染，7千餘人死亡。由於潛伏期短，針對所引發症狀無有效疫苗及藥物，伊波拉病毒被列為BSL-4級病原體。伊波拉病毒的長絲狀形狀來自於它的核蛋白與RNA結合組裝出的鬆散捲曲的核衣殼（nucleocapsid, NC）狀結構；該鬆散結構通過病毒基質蛋白VP40與核蛋白NP的C末端結合而組裝[20]。
其他類型的囊膜病毒
除了以上歸納的類型，囊膜病毒的組裝還有很多種，例如子彈型的彈狀病毒科（如狂犬病毒），橢球形的痘病毒科（如天花病毒）。
在這裡拓展介紹一下攜帶II類膜融合蛋白的囊膜病毒，其糖蛋白的多聚形式非常多樣化。除上面提到的裂谷熱、登革病毒那樣由糖蛋白的五聚、六聚體組裝為正二十面體外，還有單聚、二聚、三聚、四聚等多種形式，在病毒表面構成局部有序的網格，從而支撐病毒形態。這裡以漢坦病毒的部分相關研究為例。漢坦病毒目前分布於世界各地，由齧齒動物攜帶，一旦感染人類，便會導致嚴重的肺部疾病（NWHs）和腎症候群出血熱（OWHs）。
2016年我與同事通過對圖拉病毒（TULV, 漢坦病毒科）進行了全病毒糖蛋白外殼重構，揭示了Gn-Gc異二聚體組成的四聚體spike是如何以局部有序的網格覆蓋囊膜表面[21]。2020年，我與法國巴斯德研究所 Alexandra Serris 等同事合作，結合X-射線晶體學及cryo-ET解析了該病毒多個蛋白晶體結構及病毒原位結構，開創性地構建了漢坦病毒糖蛋白包括胞外段和跨膜區的近全長結構[22]。
其他類型囊膜病毒之一：攜帶II類膜融合蛋白的漢坦病毒，糖蛋白以二聚和四聚體的層級多聚方式組裝成網格覆蓋囊膜表面 圖源：[22]
03
推動顯微技術發展，揭示病毒全貌
囊膜病毒在人類發展史上造成過多次大流行災難，是對現代人類健康最具威脅的病原體。沒人知道，還有多少危險的烈性病毒潛伏在自然界，又何時會浮出水面。
研究囊膜病毒的天然結構，而非體外重組病毒蛋白，對於我們真正了解病毒，發現它們的弱點至關重要。而因為脂雙層參與組裝，囊膜病毒柔性極大，形態不定，完整病毒的結構解析為結構生物學帶來巨大的挑戰。冷凍電鏡斷層成像是揭示囊膜病毒全貌圖的最佳方案。
雖然目前解析度還停留在1-2納米左右，但該方法開發突飛猛進，常規獲得近原子解析度僅是時間問題。對囊膜病毒的研究，正從體外結構的傳統方向，大步邁向從細胞中直接觀測病毒生命活動的原位結構方向。冷凍電鏡結構生物學是一門高度交叉學科，匯集了分子生物學、物理學、計算機等等領域的人才和資源。
只有這些方向齊頭並進，才能推動顯微技術達到更高成像效率、更高解析度、更原位天然結構，從而回答更重要的生物問題。另一方面，對於傳染率和致死率如此高的病毒的原位結構研究本身就充滿了很大的挑戰性，需要集成高端生物成像設施的生物安全實驗室。此類實驗室目前在全球仍是屈指可數，在疫情的影響下，這也成為生命科學基礎建設的一個重要趨勢。
細胞中直接觀測病毒生命活動原位結構的裡程碑工作時間軸 圖源：[23]
「
作者簡介
李賽，清華大學研究員。研究囊膜病毒結構及高分辨冷凍電鏡斷層成像技術。
」
參考文獻（可上下滑動瀏覽）
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