2020年7月26日訊/
生物谷BIOON/---COVID-19大流行在全球範圍內是一個巨大的威脅。根據世界衛生組織（WHO）的統計，截至2020年7月3日，已有216個國家報告了COVID-19病例，確診病例超過1000萬，死亡人數約51.8萬。作為COVID-19的病原體，SARS-CoV-2引起下呼吸道感染，可進展為嚴重的急性呼吸症候群，甚至多器官衰竭。
SARS-CoV-2是一種單股正鏈RNA病毒，其基因組編碼4種結構蛋白：刺突蛋白（S）、小蛋白（E）、基質蛋白（M）和核衣殼蛋白（N）。S蛋白是一種I型融合蛋白，在病毒顆粒表面形成三聚體。它由S1和S2兩個亞基組成：S1負責受體結合，S2負責膜融合。SARS-CoV-2利用血管緊張素轉換酶2（ACE2）作為受體進入靶細胞。因此，S蛋白決定了這種病毒的感染性及其在宿主中的傳播性。由於這種蛋白是誘導保護性免疫反應的主要抗原，所有正在開發的疫苗都針對它。顯然，密切監測正在傳播的病毒中S蛋白的抗原性變化是至關重要的。鑑於它是一種高度糖基化的蛋白，研究位點特異性聚糖（glycan）對感染性和免疫逃逸的影響也具有毋庸置疑的重要性。
已知RNA病毒的突變率高於DNA病毒。表面蛋白的胺基酸變化可以顯著改變病毒功能和/或與中和抗體之間的相互作用。比如，基孔肯雅病毒E1蛋白發生的A226V突變促進了這種病毒在白紋伊蚊中的適應性，從而導致傳播性增加。同樣，伊波拉病毒GP蛋白發生的A82V突變導致病毒感染力和死亡率增加。此外，高致病性
禽流感病毒H5N1的4個胺基酸變化表現出增強的傳播性，而在H7N9病毒中，血凝素中A143V/R148K的組合胺基酸變化使得這種病毒對中和抗體的敏感性降低了10倍以上。
雖然SARS-CoV-2是最近才在人類中發現的，但是編碼S蛋白的基因突變正在不斷被報導。截至2020年5月6日，已在公共領域報導了329個S蛋白的天然變體。值得注意的是，只有13個胺基酸位點的突變率超過0.1%。初步研究提示著死亡率的增加可能與其中最主要的D614G突變有關。據推測，這種突變可能誘發了S蛋白的構象變化，從而導致感染力的增加。然而，這些報導的突變體是否會影響病毒的感染性、傳播性或與中和抗體的反應性，基本上還不清楚。
另外，影響病毒蛋白糖基化的突變也是有據可查的，這些突變也會深刻影響病毒的生命周期及其與宿主的相互作用。比如，HIV-1 Env蛋白特定位點的N-糖基化對Env的表達和組裝至關重要。某些糖基化位點的缺失可以降低Env蛋白與CD4受體的結合，從而破壞所產生的病毒顆粒的感染性。此外，糖基化位點突變也可使得病毒對抗體的中和作用產生抵抗性，而H5N1血凝素中某些糖基化位點的缺失已被發現會影響血凝素的切割、複製、穩定性和抗原性。值得注意的是，雖然SARS-CoV-2的S蛋白的糖基化程度更高，有22個潛在的N-糖基化位點，但是這些糖基化位點如何影響病毒感染力和抗體介導的中和作用仍是未知數。
在一項新的研究中，在一項新的研究中，來自中國食品藥品檢定研究院、北京協和醫學院和清華大學的研究人員研究了SARS-CoV-2 S蛋白中發生胺基酸變化的天然變體以及在推定的N-連接糖基化位點上出現胺基酸變化的突變體（下稱糖基化突變體）的生物學意義。為了實現這一點，他們構建出106種在公共領域報導的S蛋白突變體或在推定的N-連接糖基化位點上出現胺基酸變化的突變體，並使用高通量的假型病毒（pseudotyped virus）系統來分析它們的感染性和對中和抗體的反應性。他們報導，一些天然變體和糖基化突變體經進化後具有顯著的感染性和抗原性變化。相關研究結果於2020年7月17日在線發表在Cell期刊上，論文標題為「The impact of mutations in SARS-CoV-2 spike on viral infectivity and antigenicity」。論文通訊作者為中國食品藥品檢定研究院的王佑春（Youchun Wang）博士和黃維金（Weijin Huang）博士。
圖1.為這項研究選擇的胺基酸變化說明，圖片來自Cell, 2020, doi:10.1016/j.cell.2020.07.012。
通過使用SARS-CoV-2毒株Wuhan-1（GenBank：MN908947）作為模板，這些作者選取了三組天然變體和糖基化突變體來構建假型病毒。如圖1所示，A組代表了除受體結合結構域（RBD）區域之外的整個S基因（29種毒株）的所有高頻變體和與D614G的組合變體。B組包括在RBD中出現的變體（51種毒株）。雖然A組和B組中的8種單點突變，即Q239K、V341I、A435S、K458R、I472V、H519P、A831V和S943T本身並不存在，但發現它們與D614G組合出現。因此，還構建了針對這8種單點突變的假型病毒，以便與針對它們和D614G的雙位點組合突變構建的假型病毒進行比較。C組由在推定的糖基化位點（22個位點）中出現胺基酸變化的26種突變體組成，包括變體（N74K、N149H和T719A）和這些作者為分析對糖基化的影響而構建出的實驗性突變體。具體來說，針對所有22個位點（N到Q）在實驗室中構建出22種單點突變體；他們還進行了組合突變以移除RBD中的兩個糖基化位點。總的來說，他們已經構建出106種假型病毒，即80種天然變體和26種糖基化突變體（圖1）。
為了確定這些天然變體和糖基化突變體的感染性，這些作者最初利用攜帶SARS-CoV-2 S蛋白或VSV G蛋白的假型病毒感染26種細胞系。與預期的那樣，這兩種假型病毒在對這26種細胞系的感染性上存在差異（如圖2所示）。不過，他們最終選擇了四種細胞系---293T-hACE2、Huh-7、Vero 和LLC-MK2---開展實驗。利用106種假型病毒感染這些細胞系，裂解受感染的細胞系，將獲得的受感染細胞系的裂解液稀釋10倍，並分析相應裂解液稀釋後的發光值（RLU）。無論哪種假型病毒，當與參照毒株Wuhan-1的RLU值相差4倍時就被認為是顯著的。
圖2.對易感細胞系的選擇，圖片來自Cell, 2020, doi:10.1016/j.cell.2020.07.012。
這些作者首先在293T-hACE2細胞系中測試這106種假型病毒的感染性，結果表明22種假型病毒被判定為低感染性（16種天然變體和6種糖基化突變體），RLU值下降4～100倍（圖3A），其中13種假型病毒攜帶的突變位於RBD區域。天然變體V341I和實驗性糖基化突變體（N331Q +N343Q）被視為無感染性，它們都位於RBD區域。值得注意的是，N331和N343位點上的雙糖基化缺失導致病毒感染力急劇下降（1200倍），而單個位點的單糖基化缺失導致病毒感染力溫和下降：N331Q的感染力僅下降3倍，N343Q的感染力下降20倍。此外，RBD的非自然雙糖基化突變（N331Q和N343Q）導致感染力顯著降低，這提示著RBD區域的這兩個糖基化位點可能參與受體結合或維持這個區域的構象。
圖3.對天然變體和糖基化位點缺失突變的感染性分析，圖片來自Cell, 2020, doi:10.1016/j.cell.2020.07.012。
利用其他三個細胞系進一步測試了剩餘的63種天然變體的感染性（圖3B-3D）。值得注意的是，單點變體D614G以及與D614G的組合變體（D614G+L5F、D614G+V341I、D614G+K458R、D614G+I472V、D614G+D936Y、D614G+S939F和D614G+S943T）在所有4個細胞系中均表現出比參考毒株更高的感染力。而且單點變體D614G和與D614G的組合變體之間沒有發現差異，這表明增強的感染性更可能歸因於D614G本身。
在確定了感染性發生變化的天然變體（下稱感染性變體）後，這些作者接著利用13種中和單克隆抗體（mAb）著手研究這些感染性變體的抗原性。他們注意到，RBD區域的一些胺基酸變化表現出對中和mAb的敏感性發生改變（圖4）。具體來說，A475V降低了對mAb 157、247、CB6、P2C-1F11、B38和CA1的敏感性，而F490L降低了對mAb X593、261-262、H4和P2B-2F6的敏感性。此外，V483A對mAb X593和P2B-2F6產生抵抗性，L452R對mAb X593和P2B-2F6產生抵抗性。最後，Y508H對mAb H014、N439K對mAb H00S022、A831V對mAb B38、D614G+I472V對mAb X593和D614G+A435S對mAb H014的敏感性降低了4倍以上。此外，觀察到RBD區域的一些胺基酸變化，包括V367F、Q409E、Q414E、I468F、I468T、Y508H和A522V，更容易受到mAb介導的中和作用。
圖4.用一組中和單克隆抗體分析天然變體和實驗性糖基化突變體的抗原性，圖片來自Cell, 2020, doi:10.1016/j.cell.2020.07.012。
這些作者接下來確定感染性糖基化突變體如何對一系列相同的mAb作出反應。突變體N165Q實際上對mAb P2B-2F6變得更加敏感，而N234Q則降低了對包括mAb 157、247、CB6、P2C-1F11、H00S022、B38、AB35和H014在內的不同mAb的中和敏感性。這些結果證實了這兩個糖基化位點對受體結合很重要。
這些作者證實，這些mAb在對胺基酸變化的分析中是有價值的。如圖4所示，五種mAb，即mAb 157、247、CB6、P2C-1F11和B38，都不能有效中和A475V和N234Q。mAb X593和P2B-2F6均不能有效中和L452R、V483A和F490L，而mAb P2B-2F6更能有效中和N165Q。此外，mAb H014不能中和N234Q、Y508H和D614G+A435S，而mAb H4和261-262則不能中和F490L。此外，最後，mAb H00S022無法中和N439K和N234Q。
最後，這些作者測定了胺基酸發生變化的毒株對10份COVID-19患者恢復期血清的敏感性。沒有一種天然變體和糖基化突變體對所有10份恢復期血清的敏感性發生顯著改變，即與參考毒株相比，無論敏感性出現增加或減少，EC
50值發生的變化沒有超過4倍（圖5A）。然而，發現F490L和H519P對其中的3份血清的中和敏感性均下降了4倍以上，而6種天然變體/糖基化突變體（N149H、N149Q、N165Q、N354D、N709Q和N1173Q）對這10份測試血清中的1或2份血清的敏感性增加了4倍以上。值得注意的是，這6種天然變體/糖基化突變體中有5種是聚糖缺失突變體。
圖5.天然變體和實驗性糖基化突變體對一組恢復期血清樣本的不同敏感性，圖片來自Cell, 2020, doi:10.1016/j.cell.2020.07.012。
如圖5B所示，當將每份恢復期血清的數據匯集在一起來分析所有天然變體的敏感性時，沒有觀察到明顯的差異（>4倍）。然而，在一些天然變體和參考毒株之間觀察到它們對分組恢復期血清的反應性存在適度差異（4倍以內）。這些差異具有統計學意義（P<0.05）。值得一提的是，與參考毒株相比，一些天然變體包括單點變體F338L、V367F、I468F、I468T和V615L（圖5B）對恢復期血清更加敏感，而更多的天然變體對恢復期血清具有抵抗性。這些天然變體包括單個胺基酸變化，如Y145del、Q414E、N439K、G446V、K458N、I472V、A475V、T478I、V483I、F490L和A831V，以及雙胺基酸變化，包括D614G+Q321L、D614G+I472V、D614G+A831V、D614G+A879S和D614G+M1237I。
與天然變體相類似的是，雖然一些糖基化缺失對恢復期血清的敏感性幅度小於4倍，但發現這些糖基化突變體與參考毒株株（Wuhan-1）的差異仍有數倍，且有統計學意義，即糖基化突變體N331Q和N709Q顯著提高了對恢復期血清的敏感性（圖5B）。
作為一種RNA病毒，SARS-CoV-2病毒預計將隨著時間的推移在人類群體中繼續進化。密切監測傳播中的病毒毒株對病毒研究以及疫苗和藥物的開發無疑具有重要意義。在這項研究中，這些作者分析了GISAID資料庫中報告的所有S蛋白序列（超過13000個）。在過濾掉不完整、冗餘和模糊的序列後，他們將範圍縮小到80種天然變體。此外，由於病毒蛋白的糖基化已被發現會影響病毒複製和免疫反應，而SARS-CoV-2 S蛋白的糖基化程度很高，他們還在所有22個假定的糖基化位點上進行了26種替代突變。他們總共構建出106種假型病毒，從而使得能夠使用現有的方法對它們進行表徵。
表1總結了天然變體和實驗性糖基化突變體的特徵。在所有天然變體中，D614G特別值得注意。該天然變體自出現以來迅速積累，並與更多的臨床表現有關。在這項研究開始時（2020年5月6日），它佔所有傳播毒株的62.8%，但到7月3日，它已達到75.7%。這種優勢毒株可以有效感染測試的4種細胞系，比參考Wuhan-1毒株的感染力高10倍（圖3）。
表1.天然變體和糖基化突變體的特徵，圖片來自Cell, 2020, doi:10.1016/j.cell.2020.07.012。
綜上所述，這些作者分析了100多種假型病毒的感染性和它們對得到很好研究的mAb或COVID-19患者恢復期血清的中和作用的敏感性。在整個S蛋白中都觀察到了胺基酸變化。他們發現在S蛋白除RBD之外的區域中發現的一種單位點胺基酸變化（D614G）具有更強的感染力，但沒有證據表明它對中和抗體具有抵抗性。然而，尤其值得注意的是D614G日益增長的優勢。雖然這項研究中分析的一些在RBD區域出現胺基酸變化的毒株失去了感染力而表明它們可能不會廣泛流行，但是對抗體介導的中和作用的抵抗性出現增加的RBD天然變體應密切關注。此外，糖基化位點的缺失影響了它們對中和抗體的反應性，同時也影響了它們的感染性，這就強化了聚糖可以實質性影響SARS-CoV-2病毒複製和疫苗誘導的免疫反應的概念。總的來說，這些研究結果有助於闡明在人群體中傳播的病毒的一些不斷進化的毒株對感染力增強和抗原性變化的影響。（生物谷 Bioon.com）
參考資料：Qianqian Li et al. The impact of mutations in SARS-CoV-2 spike on viral infectivity and antigenicity. Cell, 2020, doi:10.1016/j.cell.2020.07.012.