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老頑童說
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相信很多人都聽過韓磊老師唱的《向天再借五百年》，歌曲中的「我真的還想再活五百年」唱出了我們絕大多數人的心聲。隨著人們對自然認知的增加以及科學知識的普及，我們已經「悲痛地」認識到「上天」是不會（當然也不能）借給我們時間的，難道我們就只能任由歲月的宰割嗎？答案是否定的！科學家們已經發現能夠通過多種幹預手段延緩衰老進程，其中也包括近年來比較受關注的措施——「清除衰老細胞」。今天小編要跟大家分享的是2020年7月發表在Trends in Molecular Medicine上的綜述文章，文章題目為「Reducing Senescent Cell Burden in Aging and Disease」。這篇文章詳細介紹了清除體內衰老細胞的方法，以及該方法預防、延緩衰老的分子機制。
通訊作者：Robert J. Pignolo
（圖片源於網絡）
摘要
細胞衰老不僅是衰老的一個主要過程，而且也是一種腫瘤抑制機制。細胞的衰老伴隨著以下特徵：不可逆的生長阻滯、凋亡抵抗、衰老相關分泌表型的產生、線粒體功能紊亂以及DNA和染色體的改變。在臨床前衰老模型中，衰老細胞的積累與多種慢性病、衰老症候群、多發病和加速衰老表型有關。在動物中，利用遺傳學和藥物學方法降低衰老細胞負擔可以預防、延緩和/或緩解各種衰老相關的疾病和後遺症。截至目前，早期臨床試驗的重點是稱為「senolytic」類的清除衰老細胞藥物的安全性和靶向性。研究人員推測這些藥理學幹預方法可能會在老年醫學領域產生革命性的影響。
亮點
（1）衰老細胞累積是衰老的一個基本過程，可導致老年性疾病的發生並影響健康壽命和縮短壽命。
（2）目前，已成功在動物模型中利用遺傳學方法實現了清除衰老細胞，並且通過藥物學方法在人和動物中均成功清除了衰老細胞。
（3）可以通過藥物學方法靶向抗凋亡網絡或衰老相關分泌表型（SASP）從而減輕衰老細胞負擔。
（4）關於「senolytic」類藥物的前期臨床研究正在解決安全性和靶向性的問題。
正文
靶向細胞衰老作為原發性衰老的幹預手段
導致原發性衰老的細胞和分子因素包括：慢性且輕微的非微生物所致的炎症、細胞衰老（詳見詞彙表注釋）、大分子（DNA、蛋白質、糖類、脂質）損傷的積累以及幹細胞和祖細胞功能失調。這些變化將導致：組織萎縮和喪失、去神經支配和肥大樣的病理生理學表型；灌注減少、對外部信號（即刺激和壓力）的應答減弱，以及對損傷的再生修復能力降低；脂肪轉化和纖維化產生；內穩態的改變。在個體水平上，原發性衰老臨床表現為機體功能下降、自我修復能力下降、脆弱程度加重、生存率降低和疾病發生率升高。
目前的研究在將細胞衰老作為基本的衰老進程方面已經取得了實質性進展，老年醫學假說也得到了許多令人鼓舞的成果的支持。在臨床前期樣本中，清除衰老細胞可改善與年齡相關的表型，包括老年綜合症、慢性疾病和適應能力減弱。在衰老動物模型中，通過遺傳學或藥理學方法清除衰老細胞的幹預措施表明，在理論上該方法可以用於改善衰老相關的人類疾病，尤其是那些受衰老細胞嚴重負擔影響的疾病（請參閱「臨床醫生視角」）。目前已有許多理論可行的措施來幹預原發性衰老過程，這些方式可能並不同於針對細胞衰老的幹預措施。但是這些過程並不一定相互排斥，而可能是相互依存的（圖1）。這表明，針對單個原發性衰老過程的任何幹預措施都可能和影響衰老的多個過程相互影響。
詞彙表
（1）凋亡：在正常生長、發育和清除潛在有害細胞（如癌前細胞或病毒感染細胞）的過程中發生的程序性細胞死亡。
（2）細胞衰老：細胞經歷不可逆生長停滯的過程，通常繼發於毒性損傷或有絲分裂信號失調。衰老細胞有幾個顯著的變化，包括染色質的表觀遺傳重塑、細胞器豐度和功能的變化以及促炎因子的分泌增加。然而，這些變化大多並不普遍，取決於細胞類型和所受到刺激的類型。
（3）疾病壓縮理論：當慢性病的發病推遲到比預期最大壽命更長時，病人受疾病困擾負擔時間即會縮短。
（4）損傷相關分子模式：從受損或壞死細胞中釋放的一系列分子，通過與模式識別受體結合激活先天免疫系統，它們促進病理性炎症反應並誘導細胞衰老。
（5）老年醫學假說：由於衰老是大多數慢性疾病和衰弱狀態的基礎，延緩原發性衰老過程的幹預措施也會同時預防、延緩或緩解多種老年性疾病。
（6）JAK/STAT：在哺乳動物中，這是一系列細胞因子和生長因子的主要調節機制，JAK途徑在衰老細胞中更為活躍，其抑制後可抑制SASP。
（7）早衰：類似於老年人的衰老表型，通常指過早的或加速的衰老。
（8）p16INK4a/Rb: p16是一種細胞周期蛋白依賴性激酶(Cyclin-Dependent Kinases, CDKs)的抑制劑，它可以阻止細胞周期蛋白D與CDK4/6結合和形成一種磷酸化視網膜母細胞瘤蛋白(Phosphorylates Retinoblastoma Protein, pRB)的活性蛋白複合物。如果Rb被CDKs磷酸化，它便會與E2F家族轉錄因子(E2F 1-3)分離，進入細胞核，促進G1-S期細胞周期轉變所必需的靶基因轉錄。為了便於理解，我們已經將這個過程進行了簡化，但是應該注意的是該過程可能涉及其他參與者，包括Rb的幾個非E2F靶基因等。p16高度甲基化、突變或缺失導致細胞周期進程失調。p16表達增加與細胞衰老有關。
（9）p53/p21: p53依賴性細胞周期阻滯是主要的應對DNA損傷的反應。p21是細胞周期依賴性激酶的抑制劑，是p53激活引起的下遊細胞周期阻滯的主要介質。p21蛋白在G1期和S期都起著調節細胞周期進程的作用。p21的激活與細胞衰老有關。
（10）端粒：染色體末端重複核苷酸序列的區域。包含蛋白質複合物形成的保護環結構，防止退化或與相鄰染色體融合。隨著複製次數的增多，端粒會逐漸變短或功能失調，端粒的長度過短或功能失調與DNA損傷反應有關，進而引發細胞衰老。
（11）轉座子：DNA中能翻譯成RNA，反向轉錄成DNA，並重新插入染色體上新位置的元素（「跳躍基因」）。轉座子可以破壞染色體結構，導致細胞內炎症和SASP產生。
臨床醫生視角
（1）衰老是慢性疾病以及身體狀況和認知能力下降的最重要的一個風險因素。
（2）衰老細胞負擔會導致老年慢性疾病、衰老症候群、誘導加速衰老（如卵巢早衰）以及衰老細胞局部堆積的病理生理過程（如骨關節炎）。
（3）衰老細胞會隨時間積累，其組織特異的負擔取決於以下因素：(i)衰老誘導因素的類型和數量；(ii)免疫系統清除能力；(iii)衰老細胞通過旁分泌和全身反應對非衰老細胞造成的旁觀者效應。
（4）靶向細胞衰老負擔或其他主要的衰老乾預手段，應該能夠防止或延緩甚至減輕多種衰老相關的疾病。此外，因為衰老細胞會花費數周時間再積累，所以間接地（不頻繁地）使用「senolytic」藥物成為可能，並可以潛在的降低藥物副作用。
第一代「senolytic」藥物當前已經上市，但是這些化合物的臨床應用還有待進行安全性、靶向性和有效性研究，以確定清除衰老細胞所需的最小/最佳劑量和用藥頻率。與其他側重招募相對健康老年人（僅患一種疾病或極少的共患病）的臨床試驗不同，使用「senolytic」藥物的臨床研究則希望招募患有多發病、衰老症候群或身體功能相對較差的老人。
圖1 原發性衰老過程的相互依賴性。
細胞衰老發生於多種細胞類型，包括幹細胞和祖細胞，並導致分化功能和組織再生能力受損。慢性炎症通過產生衰老相關的分泌表型（Senescence-Associated Secretory Phenotype, SASP）介導衰老的變化並導致損傷大分子的積累。SASP還可以促進旁分泌和全身的旁觀者效應（圖中右虛線箭頭）引起幹細胞和祖細胞功能障礙。此模式圖可以用假設驅動的方式進行驗證。
細胞衰老
儘管細胞衰老可能不是個體衰老唯一的機制，但是研究者們認為在細胞水平上其仍是主要機制。現在發現許多細胞衰老的誘導因素，包括DNA損傷、活性代謝產物、炎症、癌基因、有絲分裂原、蛋白毒性應激及損傷相關分子模式。DNA損傷反應 (DNA Damage Response, DDR) 是誘導細胞衰老的關鍵。而端粒縮短、功能障礙、突變、輻射或烷化劑都有可能引起DDR。活性代謝產物則包括活性氧、脂肪酸、高濃度的葡萄糖及神經醯胺。蛋白毒性應激及蛋白穩態喪失則與蛋白質聚集、未摺疊蛋白反應和mTOR的激活相關。上述這些誘導因素依據其類型及被誘導細胞的類型，最終通過激活p16INK4a/Rb或p53/p21通路的機制介導細胞衰老表型。細胞衰老表型的特徵包括不可逆的生長停滯、SASP（框1）、細胞凋亡抗性、線粒體功能障礙、持續DNA損傷灶以及包括衰老相關異染色質灶形成的表觀遺傳重塑。此外，轉座子可以在衰老細胞中產生，並重新插入衰老細胞DNA中，從而促進細胞衰老表型並使其SASP表達增加。
儘管衰老細胞可能產生短暫的有益作用（框2），但隨著年齡的增長，它們會在幾乎所有組織中慢慢積累，從而造成有害的後果。目前，促進局部組織功能障礙或在遠端產生有害作用所需最少衰老細胞的數量還是未知的。但是，目前我們了解到衰老靈長類動物皮膚中衰老細胞的相對豐度較低（例如10-15%），並且將少量衰老細胞移植到年輕的小鼠中也足以引起組織功能障礙。減少衰老細胞負擔的策略包括靶向抗凋亡調控網絡、減少炎性SASP及通過遺傳方法激活轉基因動物中由p16INK4a或p21Cip1啟動子驅動的凋亡信號來清除衰老細胞。
框1 衰老相關分泌表型（SASP）
SASP由促炎性細胞因子、趨化因子和胞外基質降解蛋白組成，它們具有有害的旁分泌和系統性作用，包括誘導其他健康細胞衰老中起到從旁側誘導的作用。SASP因子會根據衰老細胞的類型、衰老誘導因素、微環境信號及對其幹預的方法而有所差異。通過使用糖皮質激素、雷帕黴素、二甲雙胍、逆轉錄酶抑制劑（例如拉米夫定）或者JAK1/2抑制劑可以對SASP進行調控。在不同的幹預類型中，並非SASP的所有成分都被下調。細胞特異性SASP因子的鑑定可以提供衰老細胞的獨特特徵，這些特徵可以用作靶標和臨床幹預替代其他生物標誌物。由於未能清除衰老細胞，與可以間歇給藥以減少衰老細胞的senolytic不同，SASP抑制劑、senomodulators或senostatic等通過調節或抑制SASP的藥物，需要更規律的定期給藥
框2 細胞衰老潛在的有益作用
細胞衰老是一種抑制腫瘤的機制，但在傷口癒合以及發育中（即胚胎發生）可能還有其他有益的生理作用。與隨著年齡的增長而緩慢積累的衰老細胞相反，其他衰老樣細胞可能在重塑中起短暫的作用，並通過免疫系統將其除去。在限制繼發於肝損傷的纖維化反應以及通過誘導細胞可塑性和促進組織再生，從而促進幹細胞功能中，衰老也可能是有益的。胰腺β細胞中p16Ink4a的激活可促進葡萄糖刺激的胰島素釋放，這使在糖尿病小鼠中可以更好地控制葡萄糖。SASP還可能通過自分泌反饋迴路促進癌症前期細胞的衰老及生長阻滯。它也可能通過旁分泌機制誘導臨近的非癌細胞（但能夠分裂）的衰老，這種機制可防止相同的應激源增加惡性轉化的風險。衰老的影響可能是特異性和多效性的，因此，間歇性清除衰老細胞可能有助於避免靶向短期內有益的細胞
清除衰老細胞的遺傳模型
給藥（AP20187）後，「自殺」轉基因INK-ATTAC可以誘導消除p16Ink4a陽性的衰老細胞（圖2），即使是所佔比例相對較小的衰老細胞(約減少30%)，進而延長早衰及正常衰老小鼠的健康壽命，並可防止多種年齡相關疾病的發展。利用p16Ink4a啟動子驅動的ATTAC「自殺」轉基因小鼠（圖2）可以評估p16Ink4a驅動的細胞衰老在介導年齡相關表型中的作用。
目前的衰老細胞清除模型僅限於小鼠。然而，大鼠在老年科學研究方面有著巨大的潛力，因為它的衰老生理比小鼠更接近人類(特別是在某些與年齡有關的疾病的發病方面)，此外，它更大的尺寸允許連續的採樣和成像研究，這在小鼠中是不可行的。大鼠尤其利於認知行為、內分泌(例如葡萄糖耐量)、肌肉和心血管端點的測量，並且有著大量的隨年齡發生的生理變化歷史數據。隨著大鼠基因修飾技術的進步，目前是有可能建立大鼠衰老細胞清除模型的。例如，可以製造一種可以選擇性去除p16Ink4a陽性細胞的大鼠模型，使用該模型得到的結果能更準確地模擬細胞衰老(及其消除)對人體生理的影響。
圖2 衰老細胞清除的遺傳模型。
上圖：INK-ATTAC結構示意圖。下圖：INK-ATTAC小鼠給藥AP20187後p16Ink4a陽性衰老細胞的凋亡激活機制。由FK506結合蛋白(FKBP)和caspase 8 (CASP8)組成的融合蛋白是由衰老細胞中p16Ink4a啟動子的轉錄活性元件驅動的。小分子化合物(AP20187)導致FKBP-CASP8形成二聚體，並導致p16Ink4a陽性衰老細胞發生caspase依賴的凋亡。通過增強綠色螢光蛋白(EGFP)等標記完成對p16Ink4a陽性衰老細胞的監測。通過內在核糖體進入位點(Internal ribosome entrysites, IRES)提高了對螢光報告基因產物如EGFP的檢測。圖基於Baker等人首次報導改編。
降低衰老細胞負擔的藥物
雖然上述清除衰老細胞的遺傳學方法可以通過降低衰老細胞及衰老相關分泌表型的負擔而延長壽命，但若想將衰老細胞清除方法應用於人類還需要依賴於抗衰老藥物的研發（儘管抗衰老藥物的研發是早於並獨立於轉基因小鼠相關研究的）。根據作用機理（促進衰老細胞死亡或正常化衰老相關分泌表型），這些藥物被分為了衰老抑制劑（senolytics）和SASP抑制劑（圖3）。
衰老細胞可以抵抗凋亡刺激，可通過提高其抗凋亡防禦能力而增加其存活的可能性（框3）。在某些方面，衰老細胞與不分裂的癌細胞十分相似，如凋亡抵抗和代謝表型變化。事實上，許多一代抗衰老藥物曾被用於癌症治療，生物類黃酮是另一些抗衰老藥物。衰老抑制劑已經在臨床前模型中被用於預防、延緩和改善一些老年性疾病和症候群。理論上，靶向不同凋亡抵抗途徑衰老抑制劑的聯合應用能夠清除更多衰老細胞及多種衰老細胞亞型。第一代衰老抑制劑達沙替尼和槲皮素的聯合應用就是一個例子。達沙替尼是一種口服的SRC家族蛋白酪氨酸激酶小分子抑制劑，曾被用於治療費城染色體陽性的慢性粒細胞白血病患者。槲皮素是一種存在於許多食物中的生物類黃酮和抗氧化劑。
在改善年齡相關表型方面，利用Janus激酶/信號轉導和轉錄激活（Janus kinase/signal transducer and activator of transcription，JAK/STAT）抑制劑減弱衰老相關分泌表型的方法與利用遺傳學方法（例如使用INK-ATTAC小鼠）或衰老抑制劑（senolytics）清除衰老細胞的方法十分類似。單次劑量或間斷多次劑量的衰老抑制劑使用似乎或多或少都能改善年齡或衰老相關症狀，但是SASP抑制劑不具有這種效果，因為SASP抑制劑不能清除衰老細胞。這可能與衰老細胞被清除以後重新積累需要時間有關。基於蠑螈肢體再生及博萊黴素誘導的幼鼠衰老等研究，衰老細胞的更替大約需要4周時間。因此，間歇性地使用衰老抑制劑可能是有效降低副作用的合理方法。因為衰老細胞不能複製，所以耐藥性似乎不太可能。在年輕個體中，衰老細胞能夠被宿主免疫系統清除。因此，在某種程度上，衰老細胞的清除可以進一步優化，因為衰老抑制劑也可以延緩免疫衰老或降低非免疫的衰老細胞對免疫細胞功能的不利影響（圖3）。
衰老抑制劑能夠有效地治療直接或間接由衰老細胞積累而引起的各種疾病和現象，包括老年群體中高發病率、提前衰老（如兒童癌症倖存者、骨髓移植倖存者、早衰綜合症、肥胖引起的糖尿病、人類免疫缺陷病毒相關痴呆、卵巢早衰）、局部細胞衰老（如骨關節炎，青光眼、黃斑變性、骨不連、放療引起的旁觀者效應、特發性肺纖維化、慢性阻塞性肺疾病和菸草相關性肺損傷、動脈粥樣硬化、子癇前期、高氧致新生兒肺損傷和氣道高反應性），以及衰老症候群。另外，發病機制與衰老細胞高負荷有關的致死性疾病也可以採用衰老抑制劑治療（如特發性肺纖維化、原發性硬化性膽管炎）。衰老抑制劑也可以預防性地用於可能產生衰老細胞的臨床刺激，如化療、放療、擇期手術、骨髓移植、心肌梗死後康復、低氧復氧，以及其他與動靜脈瘻血液透析相關的刺激。
小規模試點臨床研究的早期結果表明，用衰老抑制劑清除衰老細胞的副作用較小。但是一代抗衰老藥達沙替尼的使用仍然有很多禁忌，如QTc間隔大於450ms，肝功能不全，與CYP3A4抑制劑、CYP3A4誘導劑、解酸劑、H2拮抗劑/質子泵抑制劑的相互作用，以及許多完整處方中的其他注意事項。在用於抗癌作用時的劑量和頻次下，達沙替尼會引起骨髓抑制、出血相關症狀、液體瀦留、心血管疾病、肺動脈高壓、QT延長、嚴重皮膚反應、細胞溶解症候群和胚胎毒性，但是這些副作用是否會出現在達沙替尼用於清除衰老細胞時還未可知。同樣，一代衰老抑制劑槲皮素也有潛在的藥物相互作用（如與CYP3A4的強抑制劑）和常見副作用（如頭痛），但是這些副作用在間歇性給藥時的情況也還未知。
正在進行的臨床試驗主要在解決安全性和衰老細胞的靶向性問題，並期望深入研究衰老抑制劑的療效。目前，亟需大規模的臨床試驗研究來更好地了解衰老抑制劑作為治療幹預措施的潛力，並更全面地評估其脫靶效應。目前臨床試驗的局限性包括招募規模小，缺乏適合老年人的可測量的臨床相關指標，以及缺乏遵循藥代動力學、藥效學等可作為替代終點的生物標誌物。
圖3 衰老相關分泌表型（SASP）抑制劑不能殺死衰老細胞，但可以抑制或正常化SASP。免疫清除可以減少衰老細胞的積累，但隨著年齡的增長，免疫清除能力逐漸下降。衰老抑制劑可以靶向凋亡抵抗途徑殺死衰老細胞，也可以通過清除衰老的免疫細胞提高免疫清除能力。
框3 凋亡抵抗網絡
衰老細胞的凋亡抵抗網絡包括ephrins/dependence receptors、PI3K/AKT、Bcl-2（Bcl-xl、Bcl-2、Bcl-w）、p53/FOXO4/p21/Serpine（PAI-1&2）、HIF-1α和HSP90。根據凋亡抵抗途徑的不同，衰老抑制劑靶向不同的衰老細胞亞型。例如，達沙替尼與含有dependence receptors、Src和酪氨酸激酶的凋亡抵抗途徑作用，靶向衰老的原代前脂肪組織細胞（如脂肪源性幹細胞）；槲皮素幹擾含有Bcl-2家族、p53/p21/Serpine和PI3K/AKT的凋亡抵抗網絡，靶向衰老的內皮細胞和間充質幹細胞。聯合使用以後，達沙替尼和槲皮素不僅分別靶向各自的衰老細胞亞群，還對衰老的肺和胚胎成纖維細胞起作用。
結論
目前正在探索針對主要衰老過程的多種幹預措施。其中一個重要的衰老過程即衰老細胞的負荷，它可以在臨床前水平通過遺傳和藥理學手段被靶向針對，而如今已經有了許多該方面的重大發現推動衰老醫學的發展。許多有前景的藥物幹預手段轉化為衰老治療藥物並進入了評估安全性和靶向性的階段，這些藥物應用於臨床的未來挑戰主要包括臨床試驗設計的優化、招募有風險或疾病的老年人、生物標誌物的發現以及在減輕細胞衰老相關疾病方面有效性的證明。
衰老細胞負擔的減少很可能改變臨床實踐，尤其是衰老醫學。老年人臨床試驗的主要終點很可能包括客觀和主觀兩個方面的生理功能，因為這些因素可以預測發病率和死亡率，有助於評估認知能力下降和受傷的風險，還是老年綜合症的主要組成部分，也符合在短期內可檢測的明顯改善指標。
大型臨床試驗、多樣本中多分析物的變化檢測，以及在單一研究和不同研究中生物標誌物的可行性和實用性的重複驗證，都將促進生物標誌物的發現。從長期來看，利用基於減少衰老細胞負荷的幹預措施和衰老進程的其他幹預措施，來評估慢性疾病和衰老症候群的發病延遲與發病率下降是可能的。
懸而未決的問題
（1）衰老細胞是否存在任何有益的功能，如在組織癒合過程中創造炎症環境？
（2）衰老細胞負荷一旦超過組織特異性的閾值，會促進組織功能障礙和全身有害的旁觀者效應嗎？
（3）衰老細胞的清除是否會減少其他衰老過程的影響？
（4）以怎樣的頻率使用「senolytic」類藥物能有效減少衰老細胞負擔？
（5）如何設計衰老藥物的組合應用來優化衰老細胞的清除？
（6）調節免疫系統能與衰老藥物協同促進衰老細胞清除嗎？
（7）「senolytic」類藥物是否能與特定疾病的治療產生協同作用以產生更多的有益效果？
（8）旁分泌和其他旁觀者效應是否是衰老細胞積累產生病理生理後果的主要機制？
（9）免疫清除機制是否對不同衰老細胞有相同的可及性？
來源：老頑童說
1980-2020
原標題：《【學術前沿】衰老乾預研究進展——清除衰老細胞》
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