前言
鹿明生物合作客戶四川大學華西醫院在醫學一區期刊《Cancer Research》（IF：8.378）發表題為「LncRNA SNHG10 Facilitates Hepatocarcinogenesis and Metastasis by Modulating Its Homolog SCARNA13 via a Positive Feedback Loop」的研究論文。該研究運用RNA-seq測序分析、TMT定量蛋白質組學的多層組學方法報導了SNHG10通過miR-150-5p / RPL4-c-Myb陽性反饋環調節SCARNA13的表達，而SCARNA13通過調節HCC中的SOX9促進肝癌細胞的增殖、侵襲和遷移。揭示了非編碼RNA在肝癌發生和轉移中的作用，為肝癌確定診斷和治療靶點提供新的途徑。
標題：LncRNA SNHG10通過正反饋環調節其同源基因SCARNA13促進肝癌的發生和轉移
研究對象：肝癌腫瘤及配對癌旁組織、細胞系、BALB/c裸鼠
期刊：CANCER RESEARCH
影響因子：8.378
發表時間：2019年7月
合作單位：四川大學華西醫院
運用生物技術：RNA-seq測序分析、TMT定量蛋白質組學（由上海鹿明生物科技有限公司提供技術支持）
研究背景
肝細胞癌（HCC）是常見的惡性腫瘤之一，也是癌症相關死亡的第三大主要原因。儘管臨床檢測和治療策略不斷進步，但由於早期診斷，術後高復發率和轉移，HCC患者的預後仍然很差。由於尚未完全闡明HCC的腫瘤發生和轉移的分子機制，因此鑑定關鍵的促癌分子將有助於了解HCC的發病機理並確定潛在的治療靶標。近期研究發現lncRNA和小RNA之間存在複雜的相互作用，其中一些lncRNA可以產生或調節小RNA。作為小RNA的亞類，大多數snoRNA編碼在SNHG (small nucleolar RNA host genes)的內含子中，而來自SNHG的初級RNA轉錄本外顯子被剪接成lncRNA並轉運到細胞質中，表明snoRNA與從SNHG轉錄的同源lncRNA之間可能存在潛在的相關性。本文作者對lncRNA和同源snoRNA之間的特定關係以及它們在HCC發生中的特定作用加以研究。
研究思路
實驗結果
1.SNHG10和SCARNA13在肺轉移灶以及HCC組織中升高，並且與HCC患者的預後不良有關
在利用RNA-seq比較異種移植HCC細胞和親代HCC細胞之間的表達。有101種lncRNA發生了至少2倍變化的差異表達（圖1aB）。此外，作者發現與親代HCC細胞相比，異種移植HCC細胞中有6種snoRNA上調，而2種snoRNA下調。
此外，分析了癌症基因組圖譜（TCGA）肝細胞癌（LIHC）數據存儲庫，以進一步研究這些候選lncRNA和snoRNA在肝癌發生中的作用。與相鄰非腫瘤組織相比，在HCC組織中總共有3,592個lncRNA和113個snoRNA失調（圖1aB和C）。在交集部分，發現了24個lncRNA（包括SNHG10，DLGAP1-AS2，TMEM161B-AS1，LINC01004和NNT-AS1）和6個snoRNA（SCARNA13，SNORD6，SNORD100，SNORD3A，SNORD94和SNORA71C）可能起關鍵作用，這其中包含了SNHG10和SCARNA13基因。而SNHG10和SCARNA13基因是來自同一初級RNA轉錄本的不同產物，這表明SNHG10和SCARNA13可能協同促進HCC的發生和發展。因此，作者將重點放在對lncRNA SNHG10及其同源SCARNA13的研究上。
圖1a | SNHG10和SCARNA13的鑑定及其與HCC患者預後不良的關係模型、結構、流程圖
（A）建立肺轉移篩查小鼠模型的圖解模型。（B）和（C）通過RNA序列結果與TCGA-LIHC數據存儲庫的交叉選擇候選lncRNA和snoRNA的流程圖。（D）人類14號染色體（hsa-chr14）上SNHG10和SCARNA13的基因組結構。
一方面，分析確認SNHG10和SCARNA13屬於LncRNA，沒有蛋白質編碼潛力。另一方面，通過對64對HCC組織及其鄰近正常組織中SNHG10和SCARNA13的表達水平分析發現：與鄰近的正常組織相比，HCC組織中SNHG10和SCARNA13的水平均升高，並且它們之間在統計上呈正相關關係。通過基因敲除實驗證明SNHG10和SCARNA13兩者之間存在調控關係，SNHG10可能是SCARNA13的上遊調節因子。
圖1b | SNHG10和SCARNA13的鑑定及其與HCC患者預後不良的關係
（E）TCGA-LIHC數據倉庫中SNHG10與SCARNA13表達的散點圖。（F）和（G）應用qPCR檢測64對肝癌組織及癌旁正常組織中SNHG10和SCARNA13的表達。（H）WCH資料庫中SNHG10與SCARNA13表達的散點圖。（I）和（J）64例肝癌患者SNHG10或SCARNA13表達水平與總生存率的相關性。（K）qPCR法檢測SNHG10在不同肝癌細胞系中的表達。
2.SNHG10促進肝癌細胞的發生和轉移
為了闡明SNHG10在肝癌發生和轉移中的致癌作用，作者研究了SNHG10對細胞表型的影響。SNHG10的減少會顯著抑制SNU-387和HCCLM3細胞的周期和增殖，並誘導凋亡（圖2A和B）。此外，SNHG10的沉默極大地削弱了SNU-387和HCCLM3細胞的侵襲和遷移能力（圖2C和D）。
將SNU-387和HCCLM3細胞皮下注射到裸鼠中。LV-shSNHG10組的腫瘤體積和重量均顯著低於LV-shCtrl組（圖2E–G），表明SNHG10增強了體內HCC細胞的致瘤性；將指定的SNU-387和HCCLM3細胞移植到裸鼠的肝臟中，以構建原位植入模型進行肝轉移測定。與LV-shCtrl組相比，LV-shSNHG10組的肝轉移結節的螢光素酶信號強度顯著下降（圖2H），表明SNHG10增強了HCC細胞的肝內轉移能力；
螢光素酶標記SNU-387和HCCLM3細胞，並直接接種到裸鼠的尾靜脈中進行肺轉移測定。LV-shSNHG10組小鼠的螢光素酶信號強度明顯低於LV-shCtrl組（圖2I），表明SNHG10可以促進HCC細胞的肺轉移潛能；H＆E染色顯示，LV-shSNHG10組的轉移灶在肺和肝的組織切片中顯著降低（圖2J和K）；
綜上所述，這些觀察結果表明，SNHG10在肝癌的發生和轉移中起著致癌作用。
（A）和（B）轉染了SNHG10-siRNAs和對照處理的SNU-387細胞和HCCLM3細胞的EdU免疫螢光染色分析。（C）和（D）SNHG10-siRNAs轉染和對照處理的SNU-387和HCCLM3細胞的跨孔侵襲試驗。（E-G）SNHG10基因敲除對小鼠皮下移植瘤體積和腫瘤重量的影響。（H）原位肝移植術後6周各組肝臟螢光素酶信號強度的變化。（I）各組小鼠尾靜脈注射6周後螢光素酶信號強度。（J）和（K）H&E染色顯示肺和肝組織切片中SNU-387細胞的轉移灶。
3.SCARNA13可促進肝癌細胞的發生和轉移
由於SCARNA13和SNHG10在HCC組織中同時上調，因此作者評估了SCARNA13對HCC細胞惡性表型的影響。與SNHG10相似，敲除SCARNA13可以極大地抑制細胞周期和增殖，並誘導SNU-387和HCCLM3凋亡（圖4A–H）。此外，SCARNA13的下調實質上損害了SNU-387和HCCLM3細胞的侵襲和遷移能力（圖4I–L）。這些結果確定了SCARNA13是肝癌中的致癌啟動子。
（A）和（B）CCK-8檢測轉染SCARNA13-ASOs的SNU-387和HCCLM3細胞及對照組。（C）和（D）用碘化丙啶染色法測定轉染SCARNA13-ASOs的SNU-387和HCCLM3細胞的細胞周期分布，並與對照組比較。（E）和（F）轉染SCARNA13-ASOs的SNU-387和HCCLM3細胞及對照組的EdU免疫螢光染色分析。（G）和（H）用FITC Annexin V和碘化丙啶染色在SnAU-137和HCCML 3細胞中用SCARN13 ASOS或對照轉染細胞，然後用流式細胞儀分析細胞凋亡。（I）和（J）SCARNA13-ASOs及對照轉染SNU-387和HCCLM3細胞的跨孔侵襲實驗。（K）和（L）SCARNA13-ASOs及對照轉染SNU-387和HCCLM3細胞的傷口癒合遷移實驗。
4.轉錄因子c-Myb上調SNHG10和SCARNA13水平
轉錄因子（TF）在識別並動態結合位於啟動子上的簡併序列基序中的作用在轉錄中起關鍵作用。因此，作者推測某些TF可能負責SNHG10和SCARNA13的異常表達。不同資料庫的交集確定了9個TF，它們可能與SNHG10基因的啟動子區域結合（圖4A），而在9個TF中，c-Myb表達與SNHG10和SCARNA13表達相關性最高（圖4B和C）。c-Myb的敲除顯著降低了SNU-387和HCCLM3細胞中SNHG10和SCARNA13的表達（圖4D和E），確定c-Myb是SNHG10和SCARNA13的上遊調節子。
隨後的生物信息學分析預測了SNHG10啟動子區域中的五個c-Myb結合位點（MBS）（圖4F和G）。ChIP分析證實了S-NHB10啟動子區域中c-Myb在MBS1和MBS3上的高度富集（圖4H）。總之，c-Myb可以直接結合於SNHG10的啟動子區域，從而導致HCC細胞中SNHG10和SCARNA13的上調。
（A）通過SJPAR、PROMO和LASGANA資料庫交叉得到的9個TFs可能與SNHG10基因啟動子結合。（B）和（C）TCGA-LIHC資料庫中SNHG10或SCARNA13和C-Myb表達的散點圖。（D）和（E）SNHG10和SCARNA13在c-Myb-siRNAs轉染的SNU-387和HCCLM3細胞中的表達。（F）和（G）預測c-Myb與SNHG10基因啟動子結合的示意圖及啟動子區的假定結合位點。（H）晶片法檢測c-Myb在SNHG10啟動子區MBSs上相對於IgG的富集。（I）c-Myb-siRNAs和螢光素酶報告子pEZX-PL01-SNHG10共轉染HEK293T細胞的螢光素酶活性。
4.SNHG10充當miR-150-5p的海綿以增加c-Myb表達
生物信息學分析表明，miR-150-5p可以結合SNHG10的309-315 nt位點（圖5B），分析證實SNHG10對miR-150-5p有充當海綿的作用。而前期大量文獻研究表明，miR-150-5p的過表達下調c-Myb mRNA和蛋白水平，因此可以確定c-Myb為miR-150-5p的直接靶標。作者推斷：SNHG10介導的miR-150-5p的螯合可能是c-Myb上調的關鍵。最後通過實驗該推斷得以證實。簡而言之，SNHG10充當miR-150-5p的海綿，以降低其對c-Myb的抑制作用，從而增強c-Myb的表達。同時c-Myb又可以直接上調SNHG10的表達，所以SNHG10，miR-150-5p和c-Myb可能形成一個正反饋迴路來維持SNHG10在肝癌中的高表達。
圖5 | SNHG10作為miR-150-5p的海綿
（A）SNHG10和SCARNA13的RNA-FISH分析。細胞核用DAPI染色。（B）應用生物信息學分析預測SNHG10與miR-150-5p的結合位點。（C）和（D）RIP法檢測SNHG10和miR-150-5p對SNU-387和HCCLM3細胞IgG的富集作用。（E）和（F）ChIRP法測定SNHG10和miR-150-5p在偶數和奇數探針池中的富集程度，並與SNU-387和HCCLM3細胞中設置的對照LacZ探針進行比較。（G）miR-150-5p-mimics和螢光素酶報告子pmirGLO-SNHG10或pmirGLO-SNHG10-mut（miR-150-5p）共轉染HEK293T細胞的螢光素酶活性。（H）和（I）miR-150-5p模擬物或抑制劑對肝癌細胞c-Myb的Western blot分析。
5.SNHG10通過miR-150-5p / RPL4-c-Myb正反饋環調節SCARNA13的表達
SCARNA13是由SNHG10，miR-150-5p和c-Myb組成的正反饋環的下遊效應子。作者通過一系列的實驗數據分析表明SNHG10一方面通過吸收miR-150-5p來促進c-Myb的表達，另一方面通過RPL4與c-Myb相互作用並正向調節c-Myb的轉錄活性，從而最終形成一個正反饋環路，不斷刺激SCARNA13的表達。
圖6 | SNHG10通過miR-1505p/RPL4-c-Myb-正反饋環調節SCARNA13的表達
（A）SCARNA13在有或無c-Myb siRNA和/或miR-150-5p抑制劑的肝癌細胞中的表達。（B）從ChIRP-seq結果和BioGRID相互作用資料庫的交叉點中篩選出RPL4和DDB1。（C）和（D）TCGA LIHC資料庫中SNHG10與RPL4或DDB1表達的散點圖。（E）和（F）ChIRP法檢測SNU387和HCCLM3細胞中與對照LacZ探針相對的偶數和奇數探針池中RPL4 mRNA的富集。（G）和（H）用放線菌素D（2mg/mL）阻斷SNU-387和HCCLM3細胞的新RNA合成後，用qPCR分析所示時間點RPL4 mRNA的RNA水平。（I）RPL4-siRNAs和含12個MRE的螢光素酶報告子共轉染HEK293T細胞的螢光素酶活性。（J）和（K）RPL4在c-Myb上的富集和c-Myb在RPL4上相對於IgG的富集。（L）SCARNA13在有或無c-Myb-siRNA和/或RPL4-siRNA的肝癌細胞中的表達。
6.SCARNA13通過調節SOX9介導SNHG10驅動的HCC細胞增殖，侵襲和遷移
為了進一步鑑定SCARNA13的候選下遊因子，作者使用TMT蛋白質組技術敲除SCARNA13後HCC細胞的蛋白水平變化，發現了182種差異表達蛋白，其中11種基因同時被轉錄組學和蛋白質組學檢測出差異。
SOX9的蛋白質表達水平在SCARNA13敲除後下調最顯著。因此，作者選擇SOX9作為SCARNA13的候選下遊蛋白並加以驗證。
圖8 | 轉染SCARNA13-ASOs的SNU-387和HCCLM3細胞在RNA和蛋白水平上SOX9的表達
大量研究表明，SOX9對癌細胞的細胞周期和EMT產生巨大影響。因此，作者檢測了SCARNA13敲低對細胞周期和EMT的分子標記物表達的影響。結果發現，在抑制SNU-387和HCCLM3細胞中SCARNA13後，CDK2，CDK3，細胞周期蛋白D1，細胞周期蛋白D3，ZEB1，波形蛋白，N-鈣黏著蛋白和纖連蛋白的表達水平顯著下降。相反，用SCARNA13 ASOs轉染導致HCC細胞中p21，p27和E-鈣黏蛋白的表達顯著增加。
圖9 | SCARNA13-ASOs及對照轉染SNU-387和HCCLM3細胞周期和EMT分子標記的Western blot分析
實驗結論
在本篇文章中，通過高通量RNA測序（RNA-seq），作者確定了ncRNA小核仁RNA宿主基因10（SNHG10）及其同源snoRNA SCARNA13在HCC發生和發展中的作用。SNHG10和SCARNA13均與HCC細胞的惡性生物學行為和HCC患者的不良預後密切相關。
這些研究發現表明SNHG10對腫瘤發生和轉移的促進作用是由SCARNA13介導的，其通過在HCC細胞中上調SOX9來促進細胞周期和EMT。
圖10 | 肝癌細胞中SNHG10和SCARNA13協同上調的複雜電路的示意模型
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了解非編碼RNA在腫瘤發生和轉移中的作用將為鑑定診斷分子和治療靶點建立新的途徑。本文目的為確定肝細胞癌（HCC）特異性ncRNA，並研究它們在HCC發生和轉移中的作用。作者通過RNA-seq鑑定肺轉移產生的異種移植HCC細胞，發現lncRNA SNHG10及其同源物SCARNA13可作為HCC發展和轉移的新驅動因子。在64例HCC病例中，SNHG10表達與SCARNA13表達呈正相關，而SNHG10或SCARNA13的高表達預示著患者不良預後。由於SCARNA13在SNHG10過表達和敲低後顯示出顯著的上升和下降，作者假設SNHG10可能是SCARNA13的上遊調節因子。功能實驗發現SNHG10和SCARNA13協同促成HCC細胞的惡性表型，其中SNHG10充當miR-150-5p的海綿並與RPL4 mRNA相互作用以增加c-Myb的表達和活性。而上調和過度活化的c-Myb會調節SNHG10啟動子活性從而增強SNHG10和SCARNA13的表達，形成正反饋循環並持續刺激SCARNA13表達。SCARNA13通過調節SOX9促進HCC細胞的細胞周期和上皮間質轉化（EMT）。作者通過多層組學技術手段，發現了在HCC發生和轉移過程中起重要作用的複雜調節網絡。
部分文獻參考
Lan T , Yuan K , Yan X , et al. LncRNA SNHG10 Facilitates Hepatocarcinogenesis and Metastasis by Modulating Its Homolog SCARNA13 via a Positive Feedback Loop[J]. Cancer research, 2019, 79(13):3220.