景傑編者按：蛋白質的泛素化由泛素激活酶E1、泛素結合酶E2和泛素連接酶E3共同參與完成。目前已知的E1有兩種：Uba1和Uba6。西北大學的研究人員利用正交泛素轉移技術（orthogonal ubiquitin transfer technology，OUT）結合質譜分析成功鑑定到了Uba1和Uba6的底物。該成果近日發表在的Nature communication上。景傑生物作為全球蛋白質與修飾領域的領跑者，可以為您提供完善的泛素化研究的解決方案，從高靈敏度的泛素化抗體到高通量泛素化修飾組學，為您的研究助一臂之力。
泛素（ubiquitin，UB）分子共價結合到胞內蛋白上，進而調控該蛋白的命運，例如調控蛋白降解、改變亞細胞結構定位、調節酶的活性等等。這一過程中，UB首先被E1激活，在UB的活性半胱氨酸位點與羧基端形成硫酯鍵。隨後E2結合UB並由E3將UB連接到目標蛋白上。起初人們認為Uba1是單一的E1，後研究發現Uba6也是一種可替代或者說非典型的E1，這兩種E1在很大程度上具有重疊性，是可交互使用。後來的研究表明，Uba6在胚胎發育、神經系統發育及功能、代謝活動等過程中發揮著重要的作用。到目前為止，只有少數蛋白如RGS4、RGS5、Shank3等依賴於Uba6激活其泛素化，但Uba6如何起始泛素化的過程仍然未知。為了更好的研究Uba6在泛素化中扮演的角色，西北大學的研究人員採用正交泛素轉移試驗，以區分胞內Uba1與Uba6的泛素化目標蛋白。
研究策略：改造UB 使得突變型UB（xUB）不能被野生型Uba1或Uba6激活，同時改造Uba1和Uba6上UB的結合位點，使得突變型Uba1（xUba1）和Uba6（xUba6）恢復對xUB的激活能力並且喪失對野生型UB的激活能力。由此，xUB可以通過xUba1或xUba6激活並傳遞給E2、E3以及下遊目標蛋白。在表達帶FLAG標籤的xUba1或xUba6細胞株中分別表達帶HBT標籤的xUB，使用Ni-NTA樹脂及streptavidin-agarose純化xUB連接的蛋白，隨後採用質譜鑑定，篩選出Uba1或Uba6可能的激活底物。
結果部分：體外實驗表明，該研究體系中改造過後的xUB-xUba1/ xUB-xUba6的功能接近於wtUB-wtUba1/ wtUB-wtUba6，並且可以轉移給wtUBE2D2/UbcH5b（E2）。利用慢病毒載體表達帶HBT標籤的xUB及wtUB，並感染HEK293細胞。實驗證明在HEK293細胞內xUB-xE1與UB-E1一樣具有良好的正交性。下一步純化HBT-xUB連接的胞內蛋白並用質譜檢測。在表達xUba6的細胞中鑑定出與xUB相連的蛋白有697個，在表達xUba1的細胞中鑑定出與xUB相連的蛋白有527個，其中有258個蛋白可能為xUba1與xUba6共同的底物，與之前的假設——Uba1與Uba6功能上存在重疊相一致。進一步生物信息學分析顯示線粒體功能障礙、Cdc42信號傳遞與RhoA信號傳遞可能只與Uba6的底物相關，而氧化脅迫、AMPK信號傳遞可能只與Uba1有關。隨後研究人員選取了ezrin、RNA結合蛋白CUGBP1等進行生化實驗驗證，結果表明ezrin與RNA結合蛋白CUGBP1確實為Uba6的底物，調節其發生K48位的多聚泛素化，從而被蛋白酶體降解。
由於ezrin控制上皮細胞形態發生的基底部極性，研究人員推測Uba6引起的泛素化是否與上皮細胞腺泡的形態發生有關。MCF-10A細胞在富含層粘連蛋白基膜如Matrigel上培養時可以分化形成高度組織化的acini-like球狀結構。這一體系被廣泛用於研究上皮腺泡形成中各基因的功能。在MCF-10A細胞中敲除uba6以及敲除uba6並回補uba6，結果發現敲除uba6上皮細胞腺泡顯著增大，並且接近30%的細胞不能形成典型的內腔結構。免疫螢光顯微鏡下觀察可以看到，對照組細胞中ezrin在質膜上顯著富集，而在uba6敲除細胞中ezrin分布較彌散。而uba6回補後能顯著回復細胞的表型例如增大的球狀體、ezrin亞細胞結構分布散亂等，顯示Uba6對上皮細胞acini-like的形態發生具有重要的調控作用。
這項研究採用正交泛素轉移技術，首次描述並且區分了兩種E1——Uba1和Uba6的靶標蛋白以及相關的細胞信號傳遞途徑，Uba1和Uba6的底物存在一定程度的交叉又各有其特異性，可能起始不同的E1-E2-E3途徑從而影響特定蛋白的泛素化。同時，研究人員認為，這種正交泛素轉移技術可以被進一步拓展，用於鑑定E2和E3的特異性底物，更大程度上揭示E1-E2-E3在調節不同細胞功能上發揮的作用。
參考文獻：
Liu X, Zhao B, Sun L, et al. Orthogonal ubiquitin transfer identifies ubiquitination substrates under differential control by the two ubiquitin activating enzyme. Nature Communications, 2017, 8: 14286.
值得一提的是，在蛋白質修飾和表觀遺傳領域，景傑生物是國內唯一一家以表觀遺傳學和高通量蛋白質組學為核心業務的高科技企業公司，開發有全球種類最多、覆蓋面最全的組蛋白修飾抗體和蛋白質修飾泛抗體以及國內工業界最先進的蛋白質組質譜平臺。公司開展結合自身開發的高靈敏度蛋白質修飾類泛抗體及抗體樹脂，與高通量蛋白質組學技術服務為國內外科研客戶提供了優質的修飾蛋白質組學分析，為該領域的進步做出了獨有的貢獻。（生物谷Bioon.com）
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