排除汙染因素,癌症相關突變在人原始多能幹細胞中並不豐富

2020-12-26 BioArt生物藝術

撰文 | 章臺柳

2019年，以色列希伯來大學Yishai Avior等【1】在Cell Stem Cell 雜誌發表研究，報導在1/3的人類多能幹細胞系（hPSC）中存在多個癌症相關基因的點突變。通過對大量的原始態（nave）和始發態（primed） 兩種狀態的hPSCs進行RNA-seq分析，發現多個tier 1癌症基因（癌症相關基因集）反覆出現非同義的SNPs。而且，作者強調了這些突變出現在原始態多能幹細胞中的概率比始發態高出4倍，這或與原始態需要使用幾種信號通路的化學抑制劑來維持有關【2】，選擇性致癌突變導致原始態在抑制劑存在的條件下具有生長優勢。同時，生長和癌症相關基因的突變引發了研究人員對hPSC在體外表型和體內致瘤性的關注。

近日，Cell Stem Cell雜誌背靠背發表兩篇文章，對上述研究結論進行勘誤，Cancer-Related Mutations Are Not Enriched in Naive Human Pluripotent Stem Cells和Cancer-Related Mutations Identified in Primed Human Pluripotent Stem Cells。之前研究發現的癌症相關基因的突變僅在與小鼠滋養細胞共培養時出現，這些突變完全與小鼠的參考基因組匹配。去除小鼠來源的序列後，原始態hPSCs中癌症基因多態性的實際發生機率幾乎為0。

第一篇文章來自劍橋大學的Ge Guo和Austin Smith合作。由於Avior等人2019的文章中使用了其團隊發表的數據集，觀察到原始態細胞系cR-S6EOS中出現TP53和其他基因的突變，而他們自己團隊並未觀察到，所以對該數據進行了重新分析。首先使用GATK流程分析SNPs，鑑定出～14000 SNPs，但不包含Avior 2019報導的突變（簡寫為Avior SNPs）。去除較為苛刻的過濾步驟後，觀察到相似的癌症相關突變，而且在兩種不同代數的cR-S6EOS重複樣本中鑑定出17個Avior SNPs。

數據中的原始態hPSC有兩種培養條件：1）小鼠的胚胎成纖維細胞（MEFs）作為滋養層；2）從MEFs轉移到laminin並超過3次傳代。兩種培養條件下傳代的次數是類似的，然而在laminin培養的cR-S6EOS中並未觀察到癌症相關SNPs，且Avior SNPs僅出現在MEFs培養的cR-S6EOS中，而在laminin培養中完全檢測不到。同樣的結果出現在胚胎來源的原始態細胞系HNES1中。而且兩者MEF培養中出現的癌症相關SNPs具有顯著的重合。將Avior SNPs與MEFs基因組進行比對，發現其與小鼠基因組具有>99%的相似，而與人類基因組相似度較低。XenofilteR可鑑定並去除比對到小鼠而不是人類基因組的序列，分析發現MEFs共培養樣本中，XenofilteR去除的數據序列較多，且佔總序列的比例較高。去除了小鼠的序列後，Avior SNPs在所有樣本中幾乎降低為0。XenofilteR對檢測真正的人類SNPs沒有影響，在cR-S6EOS和HNES1樣本中仍然檢測到40000個以上的SNPs；對於laminin培養的hPSCs，使用XenofilteR對SNPs數量沒有明顯影響。XenofilteR去除的序列與小鼠參考基因組匹配，與人類參考基因組具有4個以上的錯配。XenofilteR流程後依然存在3個SNPs，分別是TP53（pR181H、pR248Q）和CDK12（pE131K）。

第二篇文章來自希伯來大學的Nissim Benvenisty，Yishai Avior為一作。研究人員使用修改後的分析流程對來源於人類胚胎幹細胞系（hESC）WA01和WA09的172個公開的RNA-seq數據進行分析，這兩株細胞系已經存在並使用了20年，是hESC研究中使用最為廣泛的細胞系。在56/172個樣本中鑑定出4個不同基因的8個癌症相關點突變，其中TP53是最常見的突變基因，具有4個單獨的突變，依次還有EGFR、PATZ1和CDK12。而TP53和CDK12的突變同樣在Ge Guo等的分析中被發現。

67%的分析樣品中並不攜帶COSMIC癌症數據集的突變，然而33%的始發態hESC樣本至少有一個獲得性突變（該突變存在於COSMIC），6%具有兩個不同的突變。經過分析，93%的具有癌症相關突變的樣本沒有表現出較大的染色體畸變（52/56），僅有4個樣本表現出非整倍體，表明染色體畸變不是獲得癌症相關突變的主要驅動力。

總的來說，兩篇文章同時確認了原始態幹細胞的RNA-seq檢測出癌症相關突變的原因是小鼠基因序列的汙染，而實際上癌症突變的機率很低。為人們解除了使用多能幹細胞中，對於體外傳代過程中獲得病理性突變的擔心，進一步闡釋了多能幹細胞的安全性。

原文連結：

https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.11.014

https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.11.013

參考文獻

1. Avior, Y., Eggan, K., and Benvenisty, N. (2019). Retraction. Cell Stem Cell 28, this issue

2. Dong, C., Fischer, L.A., and Theunissen, T.W. (2019). Recent insights into the na ve state of human pluripotency and its applications. Exp. Cell Res.385, 111645.

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