隨著對腫瘤等疾病的深入認知，人們有越來越多的靶向藥物可以選擇，達到良好的疾病緩解效果。在臨床病理和基礎科研的工作中，需要對大量不同樣本進行一系列靶蛋白和生物標誌物免疫檢測。免疫組織化學作為常規病理檢測手段，是很多疾病檢測的「金標準」，不僅能夠輔助指導疾病分型，作為靶向用藥的依據；而且因其能還原組織形態、找準靶點細胞亞定位信息，在臨床前研究中也發揮著不可替代的作用。基於酪胺信號放大的螢光多重免疫組織化學法（mIHC） 是研究免疫腫瘤學的一種有價值的工具，能夠在福馬林固定、石蠟包埋的 （FFPE）組織樣本中檢測6種或更多種蛋白質/生物標誌物。
CST賽信通關於免疫組化Death Receptor Signaling信號通路圖
CST賽信通關於免疫組化Energy Metabolism信號通路圖
作為一家專注於信號轉導領域的公司，CST中國一直站在轉化醫學研究的前沿，全力為廣大研究者提供創新型的解決方案及試劑，讓CST中國的專家告訴你：做多重螢光簡單，有種多快好省的方法。
這種方法就是TSA技術（Tyramide Signal Amplification?，酪胺信號放大技術）：簡單來說，用這種方法做多重免疫螢光是利用二抗上帶有的HRP（而不是直接偶聯螢光素），來催化後續添加入體系的非活性螢光素。螢光素在HRP和過氧化氫的作用下被活化，跟臨近蛋白的酪氨酸殘基共價偶聯，使得蛋白樣品與螢光素穩定結合。然後微波處理，前一輪非共價結合的抗體被洗掉，共價結合的螢光素還留存在樣品上。再換個一抗來第二輪孵育，周而復始。等到所有抗體孵育結束，螢光素都結合好後，最後去檢測結果。
由於每次體系中都只有單一抗體孵育，因此無需擔心抗體交叉反應，以及一抗二抗種屬匹配問題，大大減少了實驗設計時不同種屬抗體選擇匹配的限制。也就是說，如果用TSA技術，同一張片子上所有的靶標都可以選用特異性高的兔單克隆抗體。搭配同一支抗兔的HRP二抗就可以進行實驗，而且信號放大的倍數大大增強。
螢光法多重免疫組化，可同時進行五個顏色通道以上，這種情況下發射光譜會重疊，我們可以藉助多光譜成像系統來解決這個問題。這是傳統間接螢光法染色和顯色法多重免疫組化所做不到的。這種方法能真實反映關鍵蛋白的表達情況和相互之間的關係，從而極大地節約珍貴的樣品。
使用TSA技術，你需要準備：
1、嚴格驗證的高特異性抗體：所有CST的IHC-P驗證過的抗體都滿足mIHC（多重螢光免疫組化）高特異性的要求
2、HRP偶聯的針對一抗種屬亞型特異的二抗
3、酪胺螢光素（PerkinElmer, Thermo Fisher Scientific等供應商）
4、多光譜成像系統（PerkinElmer等）
四事具備，你就可以開始嘗試進行TSA的多重螢光組化染色了。如何做到呢？除了優質的抗體，還需要優化的實驗方案和抗體配比，比如：如何配比抗體，如何選擇螢光素等。
解讀一下CST中國採用的基於TSA的mIHC 實驗優化原則應用手冊
基本方法
1.切片脫蠟、復水
2.抗原修復：優化抗原修複流程，儘可能最大程度修復抗原。
3.抗體濃度優化：染色前優化抗體稀釋度，提高每一個靶點的檢出率和信噪比。
4.染色：用SignalStain? Antibody Diluent #8112稀釋一抗，然後用對應的SignalStain? Boost IHC Detection Reagent (HRP, Mouse) #8125或(HRP, Rabbit) #8114作為二抗孵育，使用螢光素反應染色。
5.拍照分析：用Nuance? 多光譜成像系統（PerkinElmer公司）拍攝，也可使用其他多光譜成像系統如Vectra?, Mantra? 等。並用配套inForm? Tissue FinderTM 模式識別軟體進行成像分析。
結果
1.抗體稀釋優化
多重染色之前，先摸索單通道下每一個單抗的最佳濃度範圍。以PD-L1抗體為例，通過梯度稀釋抗體，測試陰性（PC-3）和陽性（Karpas-299）樣本的螢光強度，計算信噪比（S/N）和最高螢光強度（以每細胞平均螢光強度表示）同時能滿足的稀釋比例/範圍。
2.抗體-螢光素匹配
多重染色需要平衡待檢樣品中靶點峰度和各通道信號強度。通過此步矩陣式優化儘量做到：寡靶配強光，眾靶配弱光。
3.染色順序優化
TSA原理的多重螢光免疫組化中，由於染料是依次共價偶聯在切片上的，並需要通過加熱洗去前續抗體，因此需要確定染色順序，以保證：A.多次加熱切片不會影響後續靶點表位完整性；B.前續偶聯的螢光素能耐受後續加熱過程。
基於以上螢光素染色要點，我們可以將原來確定染色順序的排列問題 =120種情況，簡化成5 x 5=25優化測試方案。針對每一個抗體-螢光素匹配通道，根據以下表格來進行摸索：
例如，分別針對每一個抗體進行如下測試：第一位染色順序的測試中，切片PD-L1抗體孵育，Cy5?染色前已經進行了抗原修復加熱一次；在孵育之後，再微波加熱處理5次。第五位染色順序的測試中，切片PD-L1抗體孵育之前，微波加熱5次，孵育之後，然後再微波加熱一次。這樣的測試矩陣能夠測定抗體、螢光素的結合能力和穩定性。
4. 構建多光譜庫
在多色模式下，每一靶點自身產生的螢光素信號和同一組合中其他相關螢光素產生的信號同時被收集構建一個光譜庫， 進行線性分離分析。簡單來講，需要讓分析軟體認識多色模式中每一個螢光素的發射光譜，從而將針對特定靶點的真實信號同其他螢光素產生的信號區分開。並將每一個螢光素信號附以偽彩，黑色偽彩被定義為樣本自發螢光，則可以在最後圖像採集和處理時將信號減掉。
5.單通道和多通道信號對比
為了進一步優化和理解多通道染色對真實信號的影響，可以進行多色和單色染色的對比。為避免處理的差異，所有的切片都進行了同樣的加熱和冷卻處理。
6.顯色法和螢光法對比
進一步比較不同原理的染色方法，確定驗證不同靶標表達範式和表達量的真實性。圖中非連續切片，視野不同。請留意箭頭處的表達位置。
7.多通道染色（5個靶點+核復染）
此組合能夠展現出腫瘤上皮細胞（CK）、腫瘤微環境和腫瘤浸潤淋巴細胞的空間關係，可以為PD-L1療法和腫瘤免疫評分提供重要參考。
結論
TSA技術下多重螢光免疫組化相比傳統的多重螢光而言，具有：信號放大倍數高、簡化抗體選擇、易於設計優化、超多通道同時檢測 、全景展示蛋白表達特徵、節約樣品等諸多優點。而且CST所有IHC-P驗證過的抗體都可以用在這類應用中，隨著技術的推廣，更多應用手冊的更新，必將得到更廣泛的應用。
CST賽信通關於免疫組化PI3 KinaseAkt Signaling信號通路圖
CST研發科學家利用CST的優質抗體，在這個領域也花了很多功夫來嘗試，希望給廣大科研工作者更詳細的實驗方案，為大家的研究鋪平道路。強大的研發團隊目前已經將已有方案優化到了7色！所以螢光染色染出七色光再也不是傳說！