文/ Serina
在海洋中，棲息著一類美麗而神奇的生物——水母。水母是一類古老的水生無脊椎軟體動物。多數水母擁有顏色絢麗的傘性身軀及自體發光的能力，可散發出點點淡藍色螢光，與搖曳的海水相映成輝，常引人無限遐想。沒有人知道水母發光的能力是如何進化而來的，這些美麗的海洋精靈遍布在世界各地的海洋中，如繁星般點綴著浩瀚的海底世界。千百萬年來，這些美麗的水母如光明的使者，出現在詩人、畫家和攝影師的作品中，為人類藝術史增添了一抹亮色。
▲Aequorea Victoria水母
直至20世紀中期，一位日本科學家下村修才注意到並著手研究了水母這一獨特的發光現象，並發現其螢光源自一種會發光的蛋白——水母蛋白，它可以發出藍色的螢光並將其傳遞給另一種綠色螢光蛋白，最終使水母產生綠色的螢光。隨後馬丁·查爾菲及錢永健兩位科學家對GFP加以改造和利用，並正式將其成功引入整個生命科學領域，引發了一場生命科學領域細胞及蛋白研究技術的巨大革命。至今為止，利用改造後的螢光蛋白標記活體細胞的方法已在世界各實驗室得到廣泛推廣，而下村修、馬丁·查爾菲及錢永健三人也因為他們做出的巨大貢獻共同獲得了2008年諾貝爾化學獎。下面，我們將逐步介紹水母素、綠色螢光蛋白與人類科學共同發展的輝煌歷史。
▲2008年，瑞典皇家科學院將當年諾貝爾化學獎分別授予日本科學家下村修（左一）、美國科學家馬丁·查爾菲（中）和美籍華裔科學家錢永健（左三）
下村修是最早研究這種水母發光現象的科學家之一。20世紀50年代，他所在的伍茲霍爾海洋生物實驗室正致力於研究生物的發光現象。1955—1961年間，下修村已經對水螢火蟲（Cypridina）體內的發光機制進行了深入研究，並發現這種小生物的發光需藉助於其體內一種奇特的蛋白，並將其命名為螢光素酶。遺憾的是，下修村發現僅靠螢光素酶自身並不足以發光——很多年以後人們才發現螢光素酶本身沒有發光能力，但其可以催化一種叫做螢光素的小分子化合物並使其發光——但這項研究令他意識到很多海洋生物的發光能力可能依賴於其體內產生的某種發光蛋白。因此，他轉而研究更多的海洋生物，以尋找其他具有發光能力的蛋白。
後來，在其導師約翰森的建議之下，他最終決定將工作重點放在研究一種名為Aequorea victoria的水母身上。為此他和約翰森多次驅車到達華盛頓大學的星期五港實驗室打撈大量水母，並將它們分批帶回位於麻薩諸塞州的實驗室進行蛋白提取實驗。先前關於螢光素酶的研究為下村修提供了大量研究經驗，他很快發現在水母傘性區域的邊緣聚集有大量能夠發光的發光細胞，並從中分離出了一種可以發光的蛋白，並將其稱作「水母蛋白」。該研究刊登在1962年《細胞和比較生理學雜誌》上。
據稱有一天，下村修又提取了一份不能發光「失敗」的蛋白樣品，下班前隨手將其倒入水池中，並關好實驗室的燈準備回家。臨走前他例行環視了實驗室一周後準備鎖門，下一刻他驚奇地發現水池中竟散發著藍色的螢光！他立刻斷定可能是水池中的某種成分激活了水母蛋白的發光能力。在此後的幾天，他對水池中可能存在的所有離子及化學組分進行了逐一篩查，並最終發現鈣離子可以激活水母蛋白發光能力。
▲水母發光細胞在Aequorea Victoria水母中的形態。左圖為水母發光細胞的顯微圖片。中圖為Aequorea Victoria水母在黑暗中的顏色。右圖為Aequorea Victoria水母在可見光中的顏色。
1963年，下村修和約翰森等在《科學》上報導了這一神奇的蛋白結合鈣離子後發光的獨特機制。原來在未結合鈣離子時，水母蛋白可與一種名為腔腸素的小分子之間共價結合。當鈣離子存在時，每個水母蛋白可與兩個鈣離子結合，並通過氧化反應使蛋白與腔腸素之間的共價鍵斷裂，形成游離的腔腸素及CO2。由腔腸素負責發光，該反應是迅速而短暫的。自然光會削弱鈣離子與水母蛋白之間的結合能力，並最終使水母蛋白重新回到不結合鈣離子、但與腔腸素共價結合的狀態。
在自然界中，Aequorea Victoria水母在受到驚嚇時可迅速發出光芒，而數分鐘後光芒則自行消退，即是這一有趣生化反應的宏觀體現。
▲水母蛋白結合鈣離子後發光的分子機制。圖片摘自下村修獲得諾貝爾化學獎後在諾貝爾講座所做的研究報告
在其後的研究中，阿什利和裡奇韋解析了該蛋白的編碼基因，並將其表達於其它生物體中，以監測生物體內鈣離子濃度的動態變化。鈣離子是生物體中一類重要的信號分子，因此這項技術使人們首次成功觀察到活體內鈣離子濃度變化的情況。在數十年後的今天，這項技術仍是科研人員測定活體內鈣離子的主流方法之一。如2010年，武治長井實驗室在《公共科學圖書館·綜合》期刊上曾利用表達水母蛋白的動物細胞觀察其體內鈣離子的濃度變化情況。
▲體外培養的的動物細胞，在轉入水母螢光蛋白後於顯微鏡下呈現的鈣離子濃度熱圖。圖中紅色代表細胞內鈣離子濃度較高的區域，綠色代表細胞內鈣離子濃度較低的區域。
水母蛋白的發現與改造為體內鈣離子濃度的測定帶來重大的技術突破。但水母為生命科學領域做出的貢獻卻遠不止於此。
下村修在研究水母螢光蛋白時，發現高純度的水母螢光蛋白在加入鈣離子後可發出藍色的螢光，但在黑暗中水母及水母的發光細胞都呈現綠色。這是一個有趣的科學現象，下村修為此感到既新奇、又困惑。經過一系列預實驗，他推測在水母中很可能還存在另外一種蛋白，可以對水母螢光蛋白的發光特性造成一定影響。他繼續優化蛋白提取工藝，並最終證實在水母發光細胞中，確實還存在一種小分子蛋白。但這種蛋白的含量極其微弱，以至於他們無法對它的化學性質進行分析。在漫長的10年後，他終於獲取了足夠量的此種蛋白，並通過一系列實驗獲得了該蛋白的晶體結構。對蛋白晶體的研究結果顯示，這種蛋白本身不具有發光能力，但能吸收水母螢光蛋白發出的藍色光波，並將其轉化為綠色的光波放出。他將該蛋白命名為「綠色螢光蛋白」。這一出色的成果最終發表在1979年的《美國科學院院刊》中。
但遺憾的是，當時的研究者們並沒有意識到綠色螢光蛋白的應用前景。一晃20年過去了，一位在英國劍橋大學做博士後工作的馬丁·查爾菲博士偶然注意到了下村修的工作。當時馬丁·查爾菲正在研究一種名為秀麗隱杆線蟲的小型模式動物的神經元發育情況。這種小蠕蟲僅有1.5mm長，通體透明，是觀察神經細胞發育及遷徙的絕佳模式動物。但馬丁·查爾菲在顯微鏡下跟蹤神經細胞發育情況時，他發現在層層疊疊的細胞組織中跟蹤神經細胞的標記情況仍具有一定困難。在得知綠色螢光蛋白的性質後，他意識到自己或許可以將綠色螢光蛋白表達在秀麗隱杆線蟲的神經細胞中，並以此標記需要觀察的細胞，使它們在層層疊疊的透明組織中「脫穎而出」。從1992—1994年的2年間，他一直致力於在體外克隆綠色螢光蛋白的編碼基因，並先後將其成功表達在了原核模式生物大腸桿菌及秀麗隱杆線蟲中，並最終獲得了帶有綠色螢光蛋白標記的神經元的轉基因秀麗隱杆線蟲。在螢光顯微鏡下，這些線蟲經藍色激發光照射後會發射出綠色的螢光，清晰地展示了神經細胞的位置及結構，非常美麗。
這項開拓性的工作發表在當年的《科學》雜誌上。文章發表後，眾多科學家開始意識到可以利用綠色螢光蛋白對一些觀察困難的細胞、亞細胞器或蛋白進行活體成像分析。經過十餘年的發展，利用綠色螢光蛋白進行活體標記的技術已被細胞學研究領域廣泛採用，並成為一項經久不衰的經典實驗技術。
▲帶有GFP標記的秀麗隱杆線蟲神經元結構。如圖所示依次為秀麗隱杆線蟲的頭部神經節、背神經索、腹神經索及尾部神經節結構
▲利用綠色螢光標記的目標蛋白在螢光顯微鏡下進行移動的時間軌跡。如圖，上一排為帶有綠色螢光標記的目標蛋白由感染的T-淋巴細胞向未感染的T-淋巴細胞遷徙的時間軌跡。下一排為帶有綠色螢光標記的目標蛋白進入未感染的T-淋巴細胞並與之融合的時間軌跡。
隨著綠色螢光蛋白標記技術的蓬勃發展，科研人員逐漸發現單純的綠色螢光蛋白常常不能完全滿足實驗者的研究需要，有很多科研人員希望在實驗中同時標記兩種以上的細胞或蛋白，以研究它們之間的相互作用情況。針對這種需求，時任加州大學聖地牙哥分校藥理學教授以及化學與生物化學教授的錢永健博士開始著手改造並尋找綠色螢光蛋白的變體。錢永健帶領的科研團隊研究了綠色螢光蛋白的結構特點，並對其重要胺基酸位點進行了突變或置換，最終獲得了一系列綠色螢光蛋白的變種蛋白。有的較綠色螢光蛋白螢光更強、有的經激發後可發出黃色、藍色、青色及紅色螢光，為此後的科學研究提供了極大的便利。而錢永健本人也因這一突出貢獻與下村修和馬丁·查爾菲分享了2008年的諾貝爾化學獎。
▲錢永健實驗室改造的一系列螢光蛋白變體及其被激發光照射後呈現出的顏色
在無數科學家們的努力下，蟄居於水母內的水母蛋白及綠色螢光蛋白已經被導入病毒、放線菌、酵母、植物、果蠅、線蟲、小鼠、大鼠、人類細胞等幾乎所有的模式生物，為無數科學研究乃至人類重大疾病的研究做出了巨大的貢獻。螢光蛋白發出的生命之光，將繼續照亮生命科學領域未來的道路。