責編 | 兮
2021年1月13日，來自哈佛大學醫學院/波士頓兒童醫院的 Frederick W. Alt團隊在 Nature雜誌發表了題為 Loop Extrusion Mediates Physiological Igh Locus Contraction for RAG Scanning 的研究文章（本文第一作者兼共同通訊作者為代海強博士，Hongli Hu和Cheng-Sheng Lee分別為共同一作和共同通訊作者）。該文章通過構建超長VH區域翻轉小鼠模型，揭示了生理條件下小鼠祖B細胞中黏連蛋白cohesin控制的染色質環擠出介導免疫球蛋白重鏈基因（Igh）位點收縮，同時驅動RAG重組酶遠程線性掃描染色質，並且進一步揭示了cohesin釋放因子WAPL在該機制中調控生理條件下VH基因片段多樣化重組的重要機理，此項工作為該領域長期存在的核心問題提供了更加清晰而全面的認識。
該實驗室近年來一系列基於v-Abl轉化的小鼠祖B細胞（v-Abl-transformed progenitor (pro) B cells）的研究表明，當RAG結合在重組中心（recombination centre, RC）JH重組信號序列（recombination signal sequence, RSS）時， cohesin控制的染色質環擠出（chromatin loop extrusion）驅動RAG染色質掃描（RAG chromatin scanning）不但可以介導D-to-JH重組，還可以介導方向相對的RSSs和cryptic RSSs重組。RAG從重組中心DJH-RC-RSS線性掃描到其上遊方向相對的VH-RSSs時受到CTCF結合元件（CTCF-binding elements, CBEs）的阻礙。對於生理條件下原代祖B細胞（primary progenitor (pro) B cells）2.4-Mb VH區域如何發生位點收縮（locus contraction），以及VH區域遠端數以百計的功能性VH基因片段是如何與DJH-RC重組的等問題仍不清楚。長久以來，人們一直認為原代pro-B細胞遠端VHs通過VH區域位點收縮，依靠隨機擴散（diffusion）進入重組中心和DJH-RC-RSS進行重組。
為了研究cohesin控制的染色質環擠出在生理條件下對小鼠原代pro-B細胞IgH位點收縮和長距離範圍內VH多樣化重組的作用機理，作者巧妙地將小鼠2.4-Mb VH區域進行翻轉，改變了對應區域內所有VHs和它們的VH-RSSs相對重組中心DJH-RC-RSS的方向，只保留近端一個功能性的VH81X作為實驗對照，結果意外地發現超長VH翻轉區域裡真實的（bona fide）VH-RSSs幾乎不再進行重組。雖然該結果可以很好的說明VH-RSS的重組是通過RAG線性掃描染色質介導的，但是也有可能這種超長VH區域翻轉破壞了IgH位點收縮，或者以某種方式阻礙了VH-RSS向重組中心DJH-RC-RSS的隨機擴散。
該實驗室前期有關RAG 介導的off-target研究發現，cryptic RSSs序列可以短到只需是真實RSS序列中CAC三個鹼基，只要方向和重組中心RSS方向相對，RAG就可以切割。因此，作者進一步對比分析了正常和VH區域翻轉小鼠原代pro-B細胞中cryptic RSSs重組情況，發現正常2.4-Mb VH區域內cryptic RSSs，當方向和重組中心DJH-RC-RSS相對時，則發生重組，反之則不會，這些結果進一步支持了小鼠原代pro-B細胞內RAG染色質線性掃描整個VH區域。另外，VH區域翻轉小鼠提供了更加嚴格的驗證RAG線性掃描的檢測模型，令作者驚訝的是，VH區域翻轉雖然消除了原本和重組中心相對的cryptic RSSs的重組，但卻激活了對原本反向的cryptic RSS的重組，而且RAG沿著染色質一直掃描，超出了VH區域，並通過IgH上遊多個會聚型CBE染色質結構域直到端粒（圖1）。為了檢測2.4-Mb VH區域翻轉對IgH位點收縮的影響，作者通過3C-HTGTS檢測正常和VH區域翻轉小鼠原代RAG1缺失pro-B細胞內重組中心和整個VH區域的相互作用，發現VH翻轉並沒有破壞IgH位點收縮，同時染色質環擠出相關結合蛋白和IgH轉錄水平均沒有受影響。這些研究發現強力地支持在小鼠原代pro-B細胞中cohesin控制的染色質環擠出驅動RAG染色質線性掃描上遊的VH區域，從而介導VH-to-DJH的多樣化重組。
超長VH區域翻轉激活RAG沿著染色質一直掃描，超出VH區域，並通過IgH上遊多個會聚型CBE錨定的染色質結構域直到端粒，這種表型確實好得令人難以置信，同時也表明在原代pro-B細胞中存在某種機制可以在整個基因組中（不僅局限於VH區域）廣泛的解除CTCF/CBE的阻滯效應，從而允許cohesin調控的染色質環擠出驅動RAG長距離線性掃描染色質。為了闡明參與IgH位點收縮和遠端VH重組的關鍵因子，作者對小鼠原代pro-B細胞和G1期v-Abl pro-B細胞進行了轉錄組分析，發現在參與染色質環擠出的cohesin複合物因子中，cohesin釋放因子WAPL在小鼠原代pro-B細胞中表達非常低。和IgH位點收縮和RAG染色質掃描相關，之前在多種其它細胞中已證實WAPL水平下調能夠延伸CTCF錨定的染色質環狀結構域。因此，作者推測小鼠原代pro-B細胞很可能通過下調cohesin釋放因子WAPL，介導IgH位點收縮和RAG長距離掃描VH染色質區域。
為了直接檢測WAPL阻礙IgH位點收縮和VH-to-DJH重組的能力，作者在v-Abl pro-B細胞中構建了WAPL-degron降解體系。v-Abl pro-B細胞系經誘導後能長期穩定生存於G1期，並能大量激活RAG介導的D-to- JH重組，但VH-DJH重組很少，且遠端VH位點未收縮且缺乏與重組中心的相互作用。相應的，作者通過降解G1期v-Abl pro-B細胞中WAPL，不但激活VH位點收縮，還大量激活RAG線性掃描介導的遠端VH-to-DJH重組，該研究結果提供了直接的證據表明WAPL表達下調可以同時激活IgH位點收縮和VH-to-DJH重組。作者同時也翻轉了v-Abl pro-B細胞2.4-Mb的VH區域，進一步的研究發現v-Abl pro-B細胞超長VH區域翻轉對於真實VH-RSS和cryptic RSS重組的影響和對應的小鼠原代pro-B細胞是一樣的，包括延伸VH上遊cryptic RSSs重組直到端粒。這些研究發現進一步強力的支持WAPL表達下調促進IgH位點收縮和RAG方向特異的線性掃描VH區域。
該實驗室之前的研究發現，沒有結合RAG的新生重組中心（nascent RC）充當環擠出障礙，為上遊染色質通過重組中心的擠出提供了「動態」下遊錨點。然而，RAG與新生重組中心的結合可能增強正在被掃描的上遊染色質中的阻礙作用，因此擠出作用不會延伸那麼遠。基於上述實驗發現和分析，研究者針對小鼠原代pro-B細胞提出了一個全新的cohesin介導染色質環擠出驅動IgH位點緊縮和RAG染色質掃描的模型（圖2）。新生的（未與RAG結合的）DJH-RC進行的環擠出比上遊將RAG結合到RC時覆蓋的上遊染色質（隨細胞而異）的距離要大得多。如果RAG隨後在此類細胞中與DJH-RC結合，它可能會形成活躍的DJH-RC，從而可以在整個VH區域的不同擠出點處啟動環擠出介導的RAG染色質掃描，從而避免了下遊的重排和潛在的障礙。這些細胞可提供對VH區域所有VHs得更均等的掃描訪問，從而實現V(D)J重組並有助於形成多樣化抗體庫。
綜上所述，該研究為生理條件下小鼠原代pro-B細胞IgH位點收縮和V(D)J重組的調控機理提供了更加清晰而全面的認識。同時本研究關於調控cohesin介導染色質環擠出的機制可能對基因表達的調控具有更普遍的意義。文章進一步還發現，不同於本研究關於IgH的調控機制，免疫球蛋白輕鏈Igk 採用的位點收縮和重組機制仍然不清楚，為未來該領域又提出了新的引人入勝的科學問題。
原文連結：
https://doi.org/10.1038/s41586-020-03121-7
參考文獻
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