《自然·材料》微/水凝膠激活適應性免疫反應,促進傷口再生癒合

2020-12-01 Hydrogel

【科研成果】

11月，加州大學洛杉磯分校Tatiana Segura 和 Philip O. Scumpia教授團隊在《Nature Materials》刊發了Activating an adaptive immune response from a hydrogel scaffold imparts regenerative wound healing一文。他們論述了微孔退火顆粒（MAP）支架是可流動的，原位交聯的，由微凝膠結構單元組成的微孔支架，先前已證明可加速傷口癒合。為了在支架降解之前促進更廣泛的組織向內生長，旨在通過將交聯肽的手性從L-胺基酸轉換為D-胺基酸來減緩MAP降解。出乎意料的是，儘管顯示出預期的體外酶降解速度較慢，但D肽交聯的MAP水凝膠（D-MAP）加速了體內的材料降解，並為癒合的皮膚傷口帶來了顯著的組織再生，包括增加的拉伸強度和頭髮新生。MAP支架募集IL-33 2型髓樣細胞，該細胞在D肽存在下被擴增。值得注意的是，D-MAP引發了針對D-手性肽的顯著抗原特異性免疫，水凝膠誘導的皮膚再生需要完整的適應性免疫系統。這些發現表明，儘管支架降解更快，但是從生物材料產生適應性免疫應答仍足以誘導皮膚再生癒合。

【圖文解析】

1. D-手性交聯劑肽在體外減緩MAP降解

作者首先使用對映體肽來改變降解速率，而不改變水凝膠的初始材料特性（例如，疏水性，篩孔大小和電荷）。MMP可降解肽的酶促切割位點上的所有胺基酸均變為D胺基酸（Ac-GCRDGPQDGIDWDGQDRCG-NH2，D肽）。通過D肽MAP（D-MAP）和L肽（L-MAP）配方的流變學，作者將剛度（即儲能模量）與之前的基於MAP的皮膚應用（500 Pa ；圖1a）。經過配方優化後，使用先前發布的微流體技術產生了微球顆粒。將膠原酶I應用於L-MAP，D-MAP或50％D-MAP和L-MAP混合物（1：1 L/D-MAP）後，L-MAP水凝膠在幾分鐘內降解，而降解甚至在一小時後，D-MAP本身或與L-MAP的混合物中的D-MAP的含量也很小（圖1b ）。

圖1：在SKH1無毛小鼠的傷口中D-MAP水凝膠降解得到增強。

2. D-手性交聯劑肽增強體內MAP降解

由於未觀察到傷口閉合結果的差異，因此作者接下來通過檢查傷口完全癒合後21天的切除組織，檢查體內D胺基酸交聯劑的水凝膠降解是否減慢。出乎意料的是，用D-MAP或1：1 L/D-MAP水凝膠混合物處理的傷口的組織學切片在受傷後21天表現出極少至無水凝膠持久性，接近未用水凝膠治療的小鼠（假手術）所見的水平用L-MAP水凝膠處理後顯示出大量的水凝膠殘留（圖1c–f）。

3. D-MAP水凝膠賦予組織再生特性

與這些結果一致的是，未接受水凝膠(sham)的小鼠的4mm切除夾板傷口的組織學檢查顯示出典型的疤痕組織，表皮扁平，真皮層稀薄，膠原蛋白束水平，垂直血管和缺乏毛囊和皮脂腺（圖1c，g–i）。用L-MAP水凝膠處理的小鼠的組織表現出相似的外觀，但與sham傷口相比，其整體組織較厚，這是由於L-MAP水凝膠的殘留量很大（圖1d，g）。在水凝膠周圍的真皮內，成纖維細胞分泌膠原蛋白和/或細胞外基質以及在水凝膠微粒之間形成的血管（圖1d）。在傷口區域僅觀察到稀有的毛囊和相關的皮脂腺（圖1d，h，i）。值得注意的是，對D-MAP處理過的組織或1：1-L/D-MAP處理過的組織的組織學檢查表明，從頭有再生的外觀。上面的表皮通常表現出生理性起伏，並且觀察到許多未成熟的毛囊跨越癒合的全層損傷的長度（圖1e–i）。儘管這些樣品中殘留的水凝膠較少，但用D-MAP或1：1 L/D-MAP處理的樣品也顯示出增加的皮膚厚度（圖1f）。

4. D-MAP處理的傷口中的毛囊是新生的

接下來，作者在C57BL/6（B6小鼠中重複傷口癒合實驗，以研究在D-MAP處理的傷口中觀察到的再生現象是否與WIHN中相似。與SKH1小鼠中經假手術和L-MAP處理的傷口相似，沒有水凝膠（sham）的B6小鼠傷口表現出典型的疤痕外觀，並帶有蘇木精和曙紅（H＆E）以及Masson三色染色（圖2a，c，e）。相反，經D-MAP處理的組織的組織學切片顯示明顯的WIHN徵象。與SKH1小鼠一樣，經D-MAP處理的B6小鼠的傷口在表皮下顯示起伏和許多表皮囊腫，而真皮則較厚。重要的是，傷口中形成了許多新的毛囊（圖2b，d，f）。新形成的毛囊處於生長期的早期，外觀還不成熟，但是其中許多已經形成了新的皮脂腺（圖2b），並具有突出的SOX9+凸起幹細胞區域（圖2j）。在某些情況下，新生毛囊與表皮囊腫物理連接（這種形態從先前存在的毛囊中無法預期）。這表明在D-MAP處理的傷口中，表皮囊腫可能是至少一些新生毛囊從頭形態發生的起始位點（圖2h）。

圖2：D-MAP水凝膠在B6小鼠的全層皮膚傷口中誘導毛囊新生。

5. D-MAP水凝膠植入物可增強骨髓細胞募集

作者發現，僅包含L-MAP的植入物在水凝膠中顯示背景水平的CD11b細胞，如先前觀察到的1，而D-MAP或L/D-MAP導致在支架內和支架周圍大量表達CD11b的髓樣細胞積累。（圖3a，b）。

圖3：募集骨髓細胞不需要通過模式識別受體進行肽識別。

6. D-MAP引發抗原特異性體液免疫

無論是將D的MAP水凝膠應用於受傷的組織還是通過皮下植入的小鼠，小鼠都產生了針對T細胞的IgG1和IgG2a對D-胺基酸的肽的應答，而不是對T細胞的依賴性IgG3反應。這些結果與針對D肽的T細胞依賴性免疫反應更為一致（圖4a，b）。IgG1通常與Th2的「組織修復」類型反應相關，而IgG2a通常與Th1的「異物」反應相關，後者通常需要強大的佐劑才能形成，這取決於小鼠的品系37,38。當在傷口環境中給小鼠水凝膠而不是在皮下植入模型中給予水凝膠時會誘導抗D肽特異性IgG2a，這一事實表明，水凝膠本身並不具有足夠的佐劑作用。誘導強烈的Th1反應。但是，傷口環境中存在的炎症可能會導致對D-MAP的混合Th2/Th1反應（圖3e和4b）。單獨用L-MAP治療的小鼠不產生對L-肽的抗體應答。

圖4：D-MAP通過適應性免疫誘導抗體應答和骨髓細胞募集。

【總結討論】

在大多數哺乳動物中，疤痕形成和組織纖維化的自然過程是高度進化的，並且組織規模嘗試恢復關鍵的屏障功能以維持生存。但是，此過程最終是生物學上的「分類」，它有利於纖維化基質的快速沉積以恢復屏障，但以失去複雜組織的功能為代價。在皮膚中，這種纖維化反應不僅導致功能性附件結構的喪失，而且導致皮膚組織更加脆弱並且易於再損傷。工程皮膚再生的主要目標是允許屏障功能快速恢復，同時提供增加的組織抗張強度和更高的組織功能。許多基於生物材料的方法，包括添加生長因子和脫細胞的細胞外基質結構，在恢復傷口功能方面顯示出有限的成功。作者先前的研究表明，MAP支架可以加速鼠傷的傷口閉合。該文報導的發現進一步突出表明，適度適應MAP可以增強2型先天性和適應性免疫應答，從而誘導皮膚再生-毛髮新生和提高的拉伸強度（圖6）。該反應取決於對D-對映體肽的適應性免疫反應的產生，並且在不添加幹細胞，生長因子或佐劑的情況下發生。重要的是，這種再生反應與立即開始的傷口閉合脫鉤，這與產生抗原特異性免疫反應所需的時間一致。

圖6：D-MAP通過2型免疫激活將傷口命運從疤痕形成轉變為再生。

儘管適應性免疫可以促進纖維化，異物形成和生物材料植入物的排斥，但是來自包含細胞外基質的生長因子的適應性免疫激活可以增強肌肉再生。此外，還創造了其他生物材料來直接激活免疫系統的特定組成部分，將癌症作為免疫治療平臺。總之，這些研究表明，適應性免疫系統在組織修復中的作用比以前意識到的要複雜得多。作者發現表明，對無菌的，可降解的基於微粒的材料進行的工程2型免疫反應可以觸發再生而不是纖維化，並進一步支持適應性免疫細胞恢復組織功能的作用。最後，作者展示了MAP支架作為有效的免疫調節平臺的潛力。對免疫因子的未來鑑定將使平衡趨向於再生，而不是引起疤痕或異物反應，這可能會導致改進生物材料。

參考文獻：

doi.org/10.1038/s41563-020-00844-w

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