文章信息：
Use of high-throughput RT-qPCR to assess modulations of gene expression profiles related to genomic stability and interactions by cadmium
Bettina Maria Fischer, Daniel Neumann, Ann Liza Piberger, Sarah Fremgaard Risnes, Beate K?berle, Andrea Hartwig
Archives of Toxicology.
November 2016, Volume 90, Issue 11, pp 2745–2761
研究背景:
通過高通量RT-qPCR分析重金屬對細胞影響，了解化學致癌物作用模式。實驗結果表明高通量RT-qPCR可成為毒理學風險評估的有效工具。
方法
通過Fluidigm實時PCR對鎘處理的腺癌A549和上皮支氣管BEAS-2B細胞進行基因表達分析。高通量RT-qPCR分析了96個樣本中對維持基因組穩定性至關重要的95個基因，包括應激反應和DNA修復，細胞周期控制，細胞凋亡和有絲分裂信號。用GenEx軟體處理數據。
結果
通過比較癌症和非癌細胞系之間對基因表達的影響，鑑定了與其轉化狀態相關的明顯差異。揭示了不同的劑量和時間依賴性以及細胞類型特異性基因表達模式，包括誘導編碼金屬硫蛋白的基因，氧化應激反應，細胞周期控制，有絲分裂信號傳導和細胞凋亡。雖然誘導了編碼DNA損傷反應的基因，但不同的DNA修復基因在轉錄水平上被下調。因此，該方法全面概述了鎘與不同信號通路的相互作用，也反映了鎘誘導致癌性的分子作用模式。
PCR法特異性和性能的測定
圖1評估引物特異性。 a.具有相應大小的特定靶擴增子的基因NFκB，OGG1，PMAIP1，PRDX1和RRM2B的瓊脂糖凝膠電泳分析。b.OGG1，PMAIP1和RRM2B的熔解曲線，及其相應的解鏈溫度。
圖2引物效率的性能。 對a.GAPDH，b. JUN和c .SIRT2進行擴增曲線校準。標準cDNA的六個連續稀釋液（1-200倍）。 校準曲線圖（x軸log10，y軸C q值）具有線性回歸趨勢線和d .GAPDH，e. JUN和f. SIRT2的相關係數。 可以從校準曲線的斜率計算引物效率。
2. 鎘對基因表達譜的影響
對氧化應激反應相關基因的影響
圖3鎘對與攝取和氧化應激反應相關的基因表達的影響。 將BEAS-2B細胞（a）或A549細胞（b）用CdCl 2處理24小時。
圖4鎘對抗氧化防禦系統相關基因表達的影響。 BEAS-2B細胞用CdCl2處理8或24小時。
對與細胞周期調節和增殖相關的基因的影響
鎘誘導生長促進和細胞周期調節基因，然而在不同時間點產生不同的模式。
圖5.鎘對細胞周期調控和增殖相關基因表達的影響。 BEAS-2B細胞用CdCl2處理8或24小時。
對凋亡相關基因的影響
鎘通過調節編碼內源級聯因子的重要基因顯示促凋亡信號傳導。 在BEAS-2B和A549細胞中，編碼促凋亡蛋白NOXA的基因PMAIP1都被誘導轉錄。 然而，兩種細胞系中誘導強度不同。
圖6.鎘對細胞凋亡相關基因表達的影響。 將BEAS-2B細胞（a）或A549細胞（b）用CdCl 2處理8或24小時。
對DNA損傷反應和修復相關基因的影響
關於DNA損傷和DNA修復的基因，損傷基因DDIT3和GADD45A的轉錄水平高度升高，在24小時處理後，在BEAS-2B細胞中觀察到更明顯的作用。
圖7.鎘對DNA損傷反應相關基因表達的影響。 將BEAS-2B細胞（a）或A549細胞（b）用CdCl 2處理8或24小時。
圖8.鎘對DNA修復系統相關基因表達的影響。 將BEAS-2B細胞（a）或A549細胞（b）用CdCl 2處理8或24小時。
結論
高通量RT-qPCR有助於預測研究不足的物質的作用模式，可作為進一步研究蛋白質水平的基礎，為深入研究感興趣物質的分子相互作用提供全面的基礎。高通量RT-qPCR是一種有前景的毒理學風險評估工具。