今年諾貝爾化學獎三位獲獎人，打破了光學成像中長期存在的衍射極限，將螢光顯微成像的解析度帶入到「納米時代」，為生命科學研究帶來巨大變化。2014年的諾貝爾化學獎在10月8日宣布授予美國科學家埃裡克·白茲格（Eric Betzig）、威廉姆·莫納爾（William Moerner）和德國科學家施泰方·海爾（Stefan Hell），以表彰他們在超高解析度螢光顯微技術領域的貢獻。正如官方頒獎文中描述，這類技術從方法實現到在科學研究中大展身手雖然不過十幾年時間，但已對多個領域產生顯著推動，並且可以預言在未來將給生命科學研究帶來巨大的變化。
什麼是超高解析度螢光顯微技術
我們人眼一般最小能看見大約0.1毫米的東西, 而生物的基本單元 -- 細胞的直徑平均約為20微米或0.02毫米, 所以對生物微觀世界的觀察需要使用光學顯微鏡。光學顯微技術有很多優點，不但能放大微觀世界，同時還對樣品沒有損害，並且可以特異地觀察目標對象。這種特異性一般是通過螢光顯微技術實現的。螢光是物質吸收光照後發出的光，一般發射光波長比吸收光波長較長，因此可以單獨檢測螢光，對目標實現高靈敏度的檢測。然而，光學顯微鏡的解析度是有限的。由於光的衍射，即使一個無限小的光點在通過透鏡成像時也會形成一個彌散圖案，俗稱「艾裡斑」。這樣即便兩個物點相距較遠，其彌散斑卻可能很近，以致無法區分。
基於此原理，早在1873年，德國科學家恩斯特•阿貝(Ernst Abbe)提出了阿貝光學衍射極限，並作為其重要成就刻於其墓碑上。根據這個公式，光學顯微鏡的解析度約為檢測光波長的一半，300納米左右（可見光的波長為400-700納米），或是我們頭髮直徑的1/300。超高解析度螢光顯微技術通過一系列物理原理和化學機制「打破」了這一衍射極限，把光學顯微鏡的解析度提高了幾十倍，使我們以前所未有的視角觀察生物微觀世界。
為什麼生物學研究需要超高解析度螢光顯微技術
很多亞細胞結構都在微米到納米尺度，衍射極限的存在限制了我們使用光學顯微鏡觀察這些生物樣品。比如細胞的骨架蛋白微絲非常密集，在螢光顯微鏡下其圖像非常模糊，無法看到細節，而電子顯微鏡的解析度可以達到1nm左右，非常清楚地呈現了細胞骨架的細節。然而電子顯微鏡幾乎不能做活的樣品，特異性也沒有螢光顯微鏡好。因此，發展超高解析度螢光顯微技術對生物學研究意義非常重大。
超高解析度螢光顯微技術的發展歷程
目前的超高解析度螢光顯微技術大體可分為三類，包括受激發射損耗、結構光照明技術和單分子技術。其歷史大體可以追溯到上個世紀80年代。這次獲得諾貝爾化學獎的三位科學家是這個方向的先驅人物。
超高解析度螢光顯微技術的發展分為三個階段。在1994年，此次獲獎的德國人科學家施泰方·海爾當時還是博士後，最先從提出了受激發射損耗的方法（簡稱STED）來打破光學衍射極限，並最終於2000年在實驗上得以實現。其利用了類似於產生雷射的受激輻射原理，將一束形似於麵包圈的雷射光斑套在用於激發螢光的雷射光斑外，這個麵包圈雷射可以抑制其區域內螢光分子發出螢光，這樣通過不斷縮小麵包圈的孔徑就可以獲得一個小於衍射極限的螢光發光點，並通過掃描實現超高解析度的圖像，將光學顯微鏡解析度提高了近10倍。海爾現為德國哥根廷大學教授和德國馬克斯·普朗克生物物理化學研究所所長。從2000年開始，他不斷改進STED技術，使其更加適用於生物研究。另外，他還通過相似原理髮明了一系列的超高解析度技術，統稱為可逆飽和螢光躍遷（RESOLFT），為超解析度螢光顯微成像技術的發展做出了巨大貢獻。
基於結構照明原理的超高解析度技術是美國科學家麥茨·古塔弗森（Mats Gustafsson）在2000年發明的，非常適於細胞研究，可惜解析度只提高了一倍。這個技術基於兩個高空間頻率的圖案重疊可以形成低頻率莫爾條紋的原理，通過解析莫爾條紋實現超高解析度成像。可惜古塔弗森於2011年51歲時因癌症去世，英年早逝，無緣分享這次的諾貝爾獎。
超分辨螢光顯微鏡技術真正成熟並得以在生物研究中廣泛應用是自2006年同時出現的兩種基於隨機重構原理的超高解析度光學成像技術。當時是由哈佛大學莊小威教授（隨機光學重構顯微術STORM技術）、這次的諾貝爾獎得主埃裡克·白茲格（光活化定位顯微術PALM技術）以及薩繆爾·海斯（Samuel Hess，螢光活化定位顯微術fPALM技術）三個研究組分別同時獨立發明的。它們在原理非常像，都是基於螢光分子的光轉化能力和單分子定位，通過用光控制每次僅有少量隨機離散的單個螢光分子發光，並準確定位單個螢光分子艾裡光斑的中心，把多張圖片疊加形成一幅超高解析度圖像。這種「以時間換空間」的思路非常巧妙，把螢光成像的解析度一下子提高了20倍左右。圖中對細胞骨架的成像解析度已經逼近電子顯微鏡的解析度。
這次獲獎的威廉姆·莫納爾現為美國史丹福大學講座教授，是單分子螢光技術的先驅人物。他在1989年任職於美國IBM研究中心時在世界上首次實現了單個分子的光吸收的測量，並在1997年與因為綠色螢光蛋白獲得08年諾貝爾化學獎的羅傑·錢合作發現了綠色螢光蛋白的光轉化效應。而埃裡克·白茲格是美國霍華德·休斯醫學研究所的教授，是螢光顯微技術領域的領軍人物。他最早在1992年就實現了近場超高解析度螢光成像，其後在94年提出了基於單分子信號實現超高解析度成像的思想，並於2006年在實驗中得以實現。值得指出的是莊小威教授作為STORM超分辨技術的發明人，一直領導並推進著超高解析度顯微技術的發展和應用，是近8年來這個領域最活躍的研究團隊。莊小威教授本科畢業於中國科大少年班，34歲獲得哈佛大學的正教授職位，40歲成為美國科學院院士。
超高解析度成像作為一類很新的技術，突破了光學成像中的衍射極限，把傳統成像解析度提高了10到20倍，好比一個近視眼的人突然戴上了合適的眼鏡，成為研究細胞結構的利器。過去這七八年間，這些技術不斷推進，先後實現了多色、三維和活細胞高速成像。其生物應用也很廣泛，包括細胞膜蛋白分布、細胞骨架、線粒體、染色質和神經元突觸等。超高解析度技術已經出現就引起廣泛關注，先是在2006年被世界著名《科學》期刊評委年度十大技術突破，接著被生物醫學方法學最好的期刊《自然-方法》評為2008年度方法。在近期《自然-方法》的十周年特刊評出的10年10大技術中，超高解析度成像和單分子技術也都出現在榜中。
關於此次諾貝爾獎及展望
就像利用哈勃天文望遠鏡認識宇宙，人類對微觀世界的了解極大地依賴於光學顯微技術。今年諾貝爾化學獎三位獲獎人打破了光學成像中長期存在的衍射極限，將螢光顯微成像的解析度帶入到「納米時代」，讓我們能以更精確地窺探微觀世界，將為疾病研究和藥物研髮帶來革命性的變化。也可以期待為世界上方興未艾的腦計劃提供關鍵支持。有趣的是，這次的三位諾貝爾化學獎得主都是物理學博士，而這次獲獎的成果也是典型的跨界研究，結合物理思想、光學技術和化學探針為生物學研究提供了前所未有的強大工具，是一個典型的技術諾貝爾獎。事實上，生命科學和醫學領域大量的懸疑正持續吸引具有不同背景的專業人才加入到研究隊伍中來，這種交叉融合的方式將會大大促進生物醫學研究的進步。毋庸置疑，未來我們還將看到更多像這樣的跨界諾貝爾獎！
本文作者 孫育傑，北京大學生命科學學院生物動態光學成像中心研究員。主要研究方向是：單分子螢光和超高解析度成像技術在細胞生物學中的應用。