電壓/增益必須要調節嗎?

2021-02-25 FCM123

對於新的一個實驗，上機檢測第一步就是調節儀器的電壓或增益。這個需要調節嗎？應該怎麼調？應該調多大?

調節到什麼樣？

將檢測器電壓設置在足夠高的水平，以使陰性細胞/微球群體的「自發螢光」高於儀器的噪聲閾值，否則會降低弱信號的靈敏度和染色指數（信噪比）。電壓值的合適與否，將最終影響流式檢測結果，尤其是在多色實驗及弱表達（弱陽性）的樣本檢測中。

大部分的流式細胞儀每個通道都是有一個檢測器包括散射散射光通道和螢光通道；由於散射光和螢光通道的目的不同，電壓調節方式主要包括兩類：

Ø  散射光通道

Ø  螢光通道

 

散射光通道

散射光包括前向散射光（FSC）與側向散射光（SSC）。通過電壓調節使目的細胞群體在圖中全部清晰的顯示出來。如圖1，左圖中為裂完紅的粒單淋三群細胞，完全顯示到這個界面上且分群良好；右圖為培養的一群細胞，與背景噪音/碎片能明顯區分即可。

 

圖1

螢光通道

很多人習慣把螢光通道的電壓設置在使空白細胞（unstained）都在第一個數量級內的水平，如圖2這樣，認為必須要達成這樣的效果才是調整好了電壓或增益，此時的值才是最理想的。其實不然，正確的電壓或增益值是以得到良好的信噪比或染色指數（可以通用，但是染色指數更好）為準，是優化螢光檢測的關鍵因素之一。直觀看的效果就是使陰陽性分群更開。

圖2

為什麼要調節電壓？

染色指數（SI. Stain Index）

染色指數統一計算公式：

(陽性群門內的geo Mean-陰性群門內的geo Mean)/（2*陰性群的SD）

圖3

染色指數除了與樣本本身的表達量有關以外，還與螢光素、儀器本身和儀器的電壓（或增益）有關。

觀察的一種方法是通過疊加每個檢測器電壓的點圖（圖4.B），或者疊加直方圖。通過比較我們可以看到隨著檢測器電壓的增加，陰性峰和陽性峰之間分離度的改善，SI值也隨之變大。但是檢測器電壓的進一步增加將不會導致染色指數的改善，電壓增加陽性信號趨於平穩，基本不會隨檢測器電壓而變化，然而陰性群變散（圖4），SI值反而隨之變小。所以說並不是電壓越大越好。不同的儀器不同的檢測通道最好的電壓不盡相同，還需要去調試一下。

圖 4

怎樣去調？

一般只有運行/採集樣本時才能調節，電壓（增益）變大，信號變大；反之信號變小（圖5）。

圖 5

CytoFLEX/DxFLEX:可調節增益

·       可以調節數值（採集參數設置中-增益），選中相應通道，改變數值（圖6）。

·       可以選中工具欄中帶G的小手，通過拖動圖中細胞群，改變電壓值大小（圖6）。

 

圖 6

Navios：可調節電壓、增益

·       可以調節數值（Cytometer control中，Volts-電壓，Gain-增益），選中相應通道，拖動右側滾動條（圖7.左）。

·       可以勾選上QuickSET,圖的橫縱坐標會顯示藍條，可以通過拖動藍條處滑塊改變電壓值大小（圖7.中右）。

圖 7

 

MoFLO：可調節電壓、增益

 

圖 8

以上如有疑問，還請留言。如有錯誤，還望指正。

參考文獻：

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