RNA-seq的3的差異分析R包你選擇哪個

2021-01-14 生信技能樹

在2010-2015年間，RNA-seq本身就是跟現在的單細胞差不多的當紅炸子雞的地位，無數的軟體工具，網頁資料庫，測評文章湧現出來。很多課題組導師都認為做一個RNA-seq項目就能發CNS啦，就跟這兩年大家以為做一個單細胞轉錄組項目就可以發CNS的堅信程度是一模一樣的！

直到現在（2020），基於高通量測序技術的RNA-Seq方法仍然是轉錄組學研究中必不可少的工具。截止到（2016）已經普遍接受的是，標準化預處理步驟可以顯著提高分析質量，特別是對於差異基因表達分析而言。然而，彼時尚未找到金標準歸一化方法。我在生信技能樹的教程呢，通常是直接就推薦3大R包（limma，edgeR，DEseq2），轉錄組的基本分析教程合輯：

上遊分析視頻以及代碼資料在：https://share.weiyun.com/5QwKGxi

下遊主要是基於counts矩陣的標準分析的代碼 https://share.weiyun.com/50hfuLi

很多人就問我這樣推薦的理由，有沒有參考文獻，但是前些日子一直比較忙，就沒有回覆大家。恰好最近整理我五年前收集的RNA-seq資料，重新發現了一個能比較好支持3大R包（limma，edgeR，DEseq2）的文獻。

文章詳情：Maza E (2016) In Papyro Comparison of TMM (edgeR), RLE (DESeq2), and MRN Normalization Methods for a Simple Two-Conditions-Without-Replicates RNA-Seq Experimental Design. Front Genet 7:164. [article]

一圖概況如下：


文章提到了以下3個算法，做了一下測試數據的比較：

The first method is the 「Trimmed Mean of M-values」 normalization (TMM) described in and implemented in the edgeR package.The second method is the 「Relative Log Expression」 normalization (RLE) implemented in the DESeq2 package.The third method is the 「Median Ratio Normalization」 (MRN).

作者的測試數據是：a matrix of counts: 34675 rows (genes) and 9 columns (samples from 3 stages and 3 biological replicates per stage). 一個  in silico calculations carried out on a given real data set from the tomato fruit set.

作者的結論很有意思：

For a very simple experimental design, i.e., about two conditions and no replicates, users can use any of the three studied normalization methods with no impact on results.But, for a more complex experimental design, the MRN method could be adopted.

學徒作業，以僅提供bam文件的RNA-seq項目重新分析 教程提到的數據集為例子，比較3大R包（limma，edgeR，DEseq2）差異分析的結果，繪製一個韋恩圖或者其它可視化的展現形式！因為這個RNA-seq項目的資料庫連結在：https://www.ebi.ac.uk/ena/browser/view/PRJEB36947，僅僅是提供bam文件，如果你搞不定表達矩陣，可以發郵件找我索取，然後完成學徒作業！！！

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