「出道即巔峰」的edgeR或DESeq被廣泛應用於高通量測序的差異表達分析，包括環狀RNA的差異表達分析。
然而，做過環狀RNA差異表達分析的老師應該都清楚，反向剪切（back-splicing）的環狀RNA並不像mRNA或lncRNA那樣馴服。
獨特的環狀結構讓二代測序較短的讀長限制了對其鑑定以及定量，目前僅僅依靠其反向剪切序列；另外，環狀RNA的表達總是與來源基因（host gene）線性RNA的表達糾纏不清，讓我們很難區分差異是來源於反向剪切還是只是來源基因的副產物。
對此，許多軟體在識別上下功夫，比如DCC、CIRCexplorer、CIRI等等，然後用DESeq2或edgeR進行差異分析；而另一些軟體在定量上使勁，對環狀 RNA 的定量不僅僅使用反向剪切序列（BSJ），而且考慮到來源基因線性分子表達的影響，使用BS ratio進行定量，例如DCC、CIRI2、CIRIquant以及CLEAR。當然這種定量就不適合用於DESeq2或edgeR，一般可以用DCC::CircTest或CIRIquant等軟體進行差異分析。
而最近北大基礎醫學院楊恩策團隊提出了環狀RNA差異分析的新方法DEBKS，對BS ratio進行了優化（公式及圖解如下）。
對此，DEBKS設計了4個模塊（見下面的流程圖）
1. merge，整合不同樣品的環狀RNA
2. count，對來源基因的線性RNA進行定量
3. anno，評估環狀RNA長度
4. dec，檢測差異表達環狀RNA
以及兩個差異表達模式
1. paired，配對的樣品
2. unpaired，非配對的樣品
作為一款工具，我們需要首先對其性能進行評估。
作者首先用了兩套公共數據集檢測了DEBKS識別差異環狀RNA的檢出率並用RT-qPCR進行了驗證；隨後，用模擬數據對DEBKS以及其他軟體進行了評估，評估內容包括
1. 重複樣品表達一致性檢驗
2. AUC，真陽性率以及假陽性率
3. 差異表達基因檢測敏感性
4.來源基因表達對差異環狀RNA的影響
通過比較，DEBKS具有更優秀的性能並且更少受來源基因表達的影響。
由於需要包含線性剪切位點的表達（LJC），因此，DEBKS只能應用於既包含環狀 RNA又包含線性RNA的測序，例如rRNA-depleted RNA-seq或exome capture RNA-seq。
另外，基因間區的環狀RNA由於缺乏線性分子的表達，因此無法用DEBKS評估。
雖說目前差異分析幾乎被edgeR/DESeq包攬，然而面對複雜多樣的生物學情景以及日益增長的多組學信息，分析工具的多樣性和特異性是非常有必要的。
環狀RNA研究越發蓬勃，然而專門的工具卻仍舊匱乏，另外，有些工具走著走著就丟了。雖然DEBKS在文章中提到表現比較優秀，然而能不能成為環狀RNA研究的利刃，仍需要大量真實數據去檢驗。
1. Liu Z, Ding H, She J, et al. DEBKS: A Tool to Detect Differentially Expressed Circular RNA[J]. bioRxiv, 2020.
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